Modellering og Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

Summary

Modeller av svulst celle invasjonen i tre-dimensjonale ekstracellulære matrix bedre reflektere<em> In vivo</em> Situasjon enn to-dimensjonale motilitet analyser. Ved hjelp av matrix invasjonen analyser kombinert med confocal avbildning av fluorescensmerket-merkede celler, detaljert informasjon om invasjon moduser og den distinkte bidrag fra ledende versus følgende celler kan skaffes.

Abstract

Et særtrekk ved kreft malignitet er invasjon og metastasering ^1. I noen kreftformer (e. g. Glioma ^2), lokale invasjonen i omliggende friskt vev er roten årsak til sykdom og død. For andre kreftformer (e. g. Bryst, lunge, etc.), Er det prosessen med metastasering, der kreftceller flytte fra en primærtumor masse, kolonisere distal nettsteder og i siste instans bidrar til organsvikt, fører det til slutt til sykelighet og dødelighet ^3. Det har blitt anslått at invasjon og metastasering er ansvarlig for 90% av kreft dødsfall ^fire. Som et resultat, har det vært stor interesse i å identifisere molekylære prosesser og kritiske protein mediatorer av invasjon og metastasering med henblikk på å forbedre diagnostikk og behandling ^5.

En utfordring for kreft forskerne er å utvikle invasjonen analyser at tilstrekkelig ligner in vivo situasjonenfor å muliggjøre nøyaktig sykdom modellering ^6. To-dimensjonale celle motilitet analysene er kun informative om ett aspekt av invasjonen og ikke tar hensyn til ekstracellulær matrix (ECM) protein remodeling som også er et kritisk element. Nylig har forskning raffinert vår forståelse av svulst celle invasjon og avslørte at individuelle celler kan bevege seg ved avlang eller rund moduser ^7. I tillegg har det vært større forståelse for bidraget av kollektive invasjon, i hvilke celler invadere i tråder, ark og klynger, spesielt i høyt differensierte svulster som opprettholder epiteliale egenskaper, til spredning av kreft ^8.

Vi presenterer en raffinert metode ⁹ for å undersøke bidrag av kandidat proteiner til kollektive invasjon ^10. Spesielt ved å konstruere separate bassenger av celler til å uttrykke ulike fluorescerende proteiner, er det mulig å molecularly dissekere aktivitetene og proteins kreves i ledende celler versus de som kreves i følgende celler. Bruken av RNAi gir den molekylære verktøy for å eksperimentelt demontere de prosessene som er involvert i den enkelte celle invasjon samt i ulike posisjoner kollektive invasjon. I denne prosedyren, er blandinger av fluorescensmerket-merkede celler belagt på bunnen av en Transwell sett tidligere fylt med Matrigel ECM protein, da lov til å invadere "oppover" gjennom filteret og inn i Matrigel. Rekonstruksjon av z-serien image stabler, fremstilt ved confocal imaging, til tredimensjonale representasjoner tillater visualisering av kollektivt invaderende tråder og analyse av representasjon av fluorescensmerket-merkede celler i ledende versus følgende posisjoner.

Protocol

1. Retrovirale merking av celler med selvlysende proteiner Plate retrovirale emballasje celler (f.eks Phoenix) ut på 0,25 x 10 6 celler per brønn av en 6-brønn rett i 10% fetal bovine serum (FBS) / DMEM. Transfektere celler med retrovirale DNA 48 timer senere celler ved hjelp Effectene henhold til produsentens instruksjoner. Skyll brønner to ganger med medium 24 timer senere, og deretter legge 1,5 ml av 10% FBS / DMEM per brønn. Samle p…

Discussion

Matrigel invasjonen analysene har tradisjonelt blitt satt opp med celler plassert på et lag av ekstracellulært matrix protein med chemoattractant-indusert motilitet mot og gjennom et filter nederst. Invasivitet ble scoret som en funksjon av hvor mange celler kan telles på undersiden av filteret. Selv om praksis er det liten forskjell med den "omvendte" invasjon analysen beskrevet ovenfor, er det betydelig mer informasjon om prosessen med invasjonen som kan bestemmes ved å visualisere invadere celler som de…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)	GIBCO	21969
Fetal Bovine Serum	PAA	A15-101
Penicillin Streptomycin	GIBCO	15140
200 mM L-Glutamine (100x)	GIBCO	25050-032
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300
Polybrene	Sigma-Aldrich	AL-118
Lipofectamine 2000 Reagent	Invitrogen	11668019
6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size	Corning	3422
Complete Matrigel	BD Biosciences	354234
Calcein AM	Invitrogen	C1430
RNase	Qiagen	19101
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Confocal microcope	Leica	SP2MP