Modellering och Imaging 3-dimensionell Kollektiv Cell Invasion
Summary
Modeller av tumörcellen invasion till tredimensionella extracellulära matrix bättre återspegla<em> In vivo</em> Situation än tvådimensionella motilitet analyser. Använda analyser matris invasionen i kombination med konfokal avbildning av fluorescerande-märkta celler, detaljerad information om invasionen lägen och skilda typer av bidrag av ledande kontra följande celler kan erhållas.
Abstract
Ett kännetecken för cancer malignitet invasion och metastasering 1. I vissa cancerformer (e. g. Gliom 2), lokal invasion till omgivande frisk vävnad är den grundläggande orsaken till sjukdom och död. För andra cancerformer (e. g. Bröst-, lung, osv.) Är det processen att metastaser, där tumörceller flytta från en primärtumör massa, kolonisera distala platser och i slutändan bidra till organsvikt, som leder så småningom till sjuklighet och dödlighet 3. Det har uppskattats att invasion och metastasering svarar för 90% av dödsfall i cancer 4. Som ett resultat har det varit intensivt intresse för att identifiera de molekylära processerna och kritiska medlare protein invasion och metastasering i syfte att förbättra diagnos och behandling 5.
En utmaning för cancer forskare är att utveckla invasion analyser som är tillräckligt liknar in vivo situationenatt möjliggöra noggrann sjukdom modellering 6. Tvådimensionella cell motilitet analyser är bara informativt om en aspekt av invasion och inte tar hänsyn till extracellulära matrix (ECM) protein ombyggnad som också är ett viktigt inslag. Nyligen har forskning förfinat vår förståelse av tumörcellen invasion och visade att enskilda celler kan gå med avlånga eller runda lägen 7. Dessutom har det funnits en större förståelse för bidrag av kollektiva invasion, där cellerna invaderar i trådar, lakan och kluster, särskilt i högt differentierade tumörer som upprätthåller epiteliala egenskaper, spridning av cancer 8.
Vi presenterar en förfinad metod 9 för att pröva bidrag kandidaten proteiner till kollektiva invasionen 10. I synnerhet genom tekniska separata pooler av celler för att uttrycka olika fluorescerande proteiner, är det möjligt att molekylärt dissekera verksamhet och proteins krävs i ledande celler jämfört med de som krävs i följande celler. Användningen av RNAi ger molekylära verktyg för att experimentellt isär processer i enskilda celler invasion samt i olika positioner av kollektiva invasion. I detta förfarande är blandningar av fluorescerande-märkta celler pläterade på botten av en Transwell in tidigare fylld med Matrigel ECM protein, sedan får invadera "uppåt" genom filtret och in i Matrigel. Rekonstruktion av Z-serien bilden stackar, som erhållits genom konfokala bildhantering, till tredimensionella representationer möjliggör visualisering av kollektivt invadera trådar och analys av representation av fluorescerande-märkta celler i ledande kontra följande befattningar.
Protocol
Discussion
Matrigel invasionen analyser har traditionellt satts upp med celler placeras på ett lager av extracellulärt matrix protein med chemoattractant-inducerad motilitet mot och genom ett filter i botten. Invasivt var fick som en funktion av hur många celler kunde räknas på undersidan av filtret. Även om praktiskt taget det är liten skillnad med den "omvända" invasion analys som beskrivs ovan, finns det betydligt mer information om processen för invasion som kan bestämmas genom att visualisera invaderande c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen av denna forskning är från Cancer Research Storbritannien.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO | 21969 |
| Fetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO | 25050-032 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| 6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size | Corning | 3422 |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 |
| RNase | Qiagen | 19101 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
| Confocal microcope | Leica | SP2MP |
References
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
- Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
- Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
- Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).
