Nous décrivons un ensemble de tests pour analyser les niveaux d'expression des histones H1. ARNm de gènes H1 individuels sont mesurés quantitativement par transcription inverse amorce aléatoire basé suivie par PCR en temps réel, alors que la quantification des protéines histones H1 de est obtenue par une analyse HPLC.
Linker histone H1 se lie à la particule de noyau nucléosome et l'ADN linker, pour faciliter le pliage de la chromatine dans la structure d'ordre supérieur. H1 est essentielle pour le développement des mammifères 1 et régule l'expression génique spécifique in vivo 2-4. Parmi les protéines hautement conservées des histones, la famille des histones H1 est le groupe le plus hétérogène. Il ya 11 sous-types H1 chez les mammifères qui sont différentiellement régulés au cours du développement et dans différents types cellulaires. Ces sous-types H1 comprennent 5 somatiques H1 (H1a-e), le H1 0 remplacement, 4 germinales sous-types de cellules H1 spécifiques, et H1x 5. La présence de sous-types H1 multiples qui diffèrent de l'affinité de liaison à l'ADN et la capacité compaction de la chromatine 6-9 fournit un niveau supplémentaire de modulation de la fonction chromatine. Ainsi, l'analyse d'expression quantitative des sous-types H1 individuels, à la fois de l'ARNm et de protéines, est nécessaire pour une meilleure compréhension de la régulation de l'enseignement supérieurstructure de la chromatine ordre et la fonction.
Nous décrivons ici un ensemble de tests conçus pour analyser les niveaux d'expression des sous-types H1 individuels (Figure 1). expression des ARNm de différents gènes variants H1 est mesurée par un ensemble de très sensibles et quantitative RT-PCR (qRT-PCR), qui sont plus rapides, plus précis et nécessitent des échantillons beaucoup moins par rapport à l'approche alternative de l'analyse par Northern blot. Contrairement à la plupart des autres messages d'ARNm cellulaires, les ARNm des gènes les plus histones, y compris la majorité des gènes H1, n'ont pas une longue queue polyA, mais qui contiennent une structure en tige-boucle à la région 3 'non traduite (UTR) 10. Par conséquent, les ADNc sont préparés à partir d'ARN totaux par transcription inverse en utilisant des amorces aléatoires au lieu d'oligo-dT amorces. En temps réel PCR avec des amorces spécifiques à chaque sous-types H1 (Tableau 1) sont effectuées pour obtenir une mesure hautement quantitative des taux d'ARNm de sous-type H1 individuelles. Expression des gènes de ménage sont analysés comme des contrôles pour la normalisation.
L'abondance relative des protéines de chaque sous-type H1 et histones est obtenue par chromatographie en phase liquide inverse à haute performance (CLHP-PI) l'analyse des histones totaux extraits de cellules de mammifères 11-13. La méthode par CLHP et les conditions d'élution décrites ici donnent des séparations optimales de sous-types H1 souris. En quantifiant le profil HPLC, nous calculons la proportion relative des sous-types H1 individuels au sein de la famille H1, ainsi que de déterminer le ratio de H1 à nucléosome dans les cellules.
L'ensemble des analyses présentées ici permettent une analyse complète des niveaux d'expression de mammifères linker sous-types d'histones. Bien conçus qRT-PCR fournir des mesures très sensibles et précises de messages d'ARN à partir des gènes de mammifères histone H1. La partie critique de qRT-PCR pour l'éditeur de liens de sous-type gènes des histones est la préparation de l'ADNc en utilisant une amorce aléatoire basé transcription inverse. ARNm des gènes les plus histones, y co…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu par le NIH de subvention et d'un cancer GM085261 Géorgie Coalition Scholar Award distingué (à YF).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
EDTA | Sigma | E-5134 |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |