Análise de Expressão de mamíferos Linker-histona Subtipos
Summary
Nós descrevemos um conjunto de ensaios para analisar os níveis de expressão de histonas linker H1. mRNA de genes H1 individuais são quantitativamente medido por acaso a transcrição reversa com base iniciador seguido por PCR em tempo real, enquanto que a quantificação de proteína de histonas H1 é conseguido através da análise por HPLC.
Abstract
Histona H1 Linker liga-se à partícula núcleo nucleossomo e DNA linker, facilitando o dobramento da cromatina em estrutura de ordem superior. H1 é essencial para o desenvolvimento de mamíferos 1 e regula a expressão do gene específica in vivo 2-4. Entre as proteínas altamente conservadas histona, a família de histonas linker H1 é o grupo mais heterogénea. Existem 11 subtipos H1 em mamíferos que são diferencialmente regulados durante o desenvolvimento e em diferentes tipos celulares. Estes subtipos H1 incluem 5 somática H1s (H1a-e), o H1 substituição 0, 4 subtipos de células germinativas H1 específicos, e H1x 5. A presença de subtipos H1 múltiplas que diferem na afinidade de ligação ao ADN ea capacidade de compactação cromatina 6-9 fornece um nível adicional de modulação da função da cromatina. Assim, a análise quantitativa da expressão subtipos H1 individuais, tanto de ARNm e as proteínas, é necessário para melhor compreensão da regulação de maiorestrutura de ordem cromatina e função.
Descrevemos aqui um conjunto de ensaios concebidos para analisar os níveis de expressão dos subtipos H1 individuais (Figura 1). a expressão do mRNA de genes de variantes diferentes H1 é medido por um conjunto de altamente sensíveis e quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR), que são mais rápida, mais precisa e requerem amostras muito menos em comparação com a abordagem alternativa de análise de Northern blot. Ao contrário da maioria outras mensagens de ARNm celulares, mRNAs para os genes mais histona, incluindo a maioria dos genes H1, carecem de uma cauda poliA de comprimento, mas contêm uma estrutura de haste loop-na extremidade 3 'região não traduzida (UTR) 10. Portanto, cDNAs são preparados a partir de RNA total por transcrição inversa utilizando iniciadores aleatórios, em vez de oligo-dT iniciadores. Os ensaios em tempo real de PCR com primers específicos para cada subtipos H1 (Tabela 1) são realizados para obter medições altamente quantitativa dos níveis de mRNA de subtipo H1 indivíduos. A expressão de genes de limpeza são analisados como controlos para a normalização.
A abundância relativa de proteínas de cada subtipo H1 e histonas núcleo é obtido através de cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho (RP-HPLC) análise de histonas total extraído de células de mamíferos 11-13. O método de HPLC e as condições de eluição descrito aqui dar separações óptimas de subtipos H1 do rato. Pela quantificação do perfil de HPLC, calcula-se a proporção relativa de subtipos H1 individuais dentro da família H1, bem como determinar a H1 a razão de nucleossomas nas células.
Protocol
Discussion
O conjunto de ensaios aqui apresentados permitir uma análise abrangente dos níveis de expressão de mamífero vinculador subtipos histonas. Adequadamente projetados qRT-PCR ensaios fornecem medições altamente sensível e precisa de mensagens de RNA a partir de quaisquer genes de mamíferos histona H1. A parte crítica de qRT-PCR ensaios para linker genes subtipo histona é a preparação de ADNc utilizando o iniciador aleatório baseado transcrição reversa. mRNA de genes mais histona, incluindo genes mais H1, não…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo NIH concessão GM085261 e um Cancer Coalition Geórgia Prêmio Distinguished Scholar (a FA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
References
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