Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi
Summary
Biz H1 bağlayıcı histonlarının ekspresyon düzeyleri analiz testleri bir dizi açıklar. H1 histon protein miktarının HPLC analizi ile elde edilir ise bireysel H1 genlerin mRNA kantitatif gerçek zamanlı PCR ile takip rastgele astar göre ters transkripsiyon ile ölçülür.
Abstract
Linker histon H1 yüksek mertebeden yapıya kromatin katlama kolaylaştırılması, nükleozom temel parçacık ve bağlayıcı DNA'ya bağlanır. H1 memeli gelişimi 1 için gereklidir ve in vivo 2-4 spesifik gen ekspresyonunu düzenler. Ölçüde korunmuş histon proteinler arasında, H1 bağlayıcı histonlarının ailesinin en heterojen bir gruptur. Ayirt geliştirme sırasında ve farklı hücre tipleri düzenlenmiştir memelilerde 11 H1 alt tipi vardır. Bunlar, H1 alt türleri 5 somatik H1S (H1A-e), değiştirilmesi H1 0, 4 mikrop hücre özel H1 alt türleri ve H1x 5 içerir. DNA bağlanma afinitesi ve kromatin sıkıştırma yeteneği 6-9 farklı birden fazla H1 alt tiplerinin varlığı kromatin fonksiyonu modülasyonu ek bir düzeyi sağlar. Böylece, mRNA ve protein hem bireysel H1 alt tiplerinin kantitatif ekspresyon analizi, yüksek düzenlenmesinde daha iyi anlaşılması için gerekli olansipariş kromatin yapısı ve fonksiyonu.
Burada tek tek H1 alt tiplerinin ifade seviyeleri (Şekil 1) analiz etmek için tasarlanmıştır deneyleri, bir dizi açıklanmaktadır. Çeşitli H1 varyantı genlerin ekspresyonunu daha doğru, hızlı ve Northern blot analizi alternatif bir yaklaşım ile karşılaştırıldığında çok daha az örnekleri gerektiren son derece hassas ve nicel ters transkripsiyon-PCR (QRT-PCR) deneyleri, bir dizi ile ölçülür. Diğer birçok hücresel mRNA mesajları aksine, H1 genlerin çoğu dahil olmak üzere en histon genler, mRNA'lar için uzun bir polyA sahip değildir, ama 3 'tercüme edilmemiş bölgesinin (UTR) 10 azından bir kök döngülü yapısını içermektedir. Bu nedenle, cDNAlann yerine oligo-dT primerlerin rastgele primerler kullanılarak, ters transkriptaz toplam RNA ile hazırlanır. Her H1 alt tipleri (Tablo 1) spesifik primerler Realtime PCR bireysel H1 alt mRNA düzeylerinin oldukça yüksek kantitatif ölçümü elde etmek için yapılırs. Housekeeping gen ekspresyonu normalleşmesi için kontrol olarak analiz edilir.
Her bir alt tipi H1 ve çekirdek histonlarının proteinlerin nispi bolluk 11-13 memeli hücreleri elde toplam histonlarının ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) analizi ile elde edilir. HPLC yöntemi ve çıkma koşulları burada fare H1 alt optimum ayrımlarını verir nitelendirdi. HPLC profili miktarının, biz de hücrelerde nükleozom oranı H1 belirlemek olarak, H1, aile içinde bireysel H1 alt tiplerinin nispi hesaplayabilirsiniz.
Protocol
Discussion
Tahlillerin seti memeli bağlayıcı histon alt tiplerinin ifade seviyelerinin kapsamlı analiz olanak sunuldu. Düzgün tasarlanmış QRT-PCR herhangi bir memeli H1 histon genleri RNA mesaj son derece hassas ve doğru ölçüm sağlar. Bağlayıcı histon alt genler için QRT-PCR testlerinin kritik parçası ters transkripsiyon dayalı rastgele astar kullanılarak cDNA hazırlıktır. En H1 genler dahil olmak üzere en histon genler, mRNA diğer hücre mRNA'lar sunulan uzun bir poli-A kuyruklu içermezler. Böylece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe GM085261 ve Gürcistan Kanseri Koalisyonu Seçkin Bilim Adamı Ödülü (YF için) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th’ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
