Ex Vivo modelo organotípico córnea de Agudos Herpes simplex vírus tipo epiteliais eu Infecção

Summary

Neste artigo de vídeo que descreve o uso de um novo<em> Ex vivo</em> Modelo de herpes simplex vírus tipo agudos eu infecção do epitélio da córnea.

Abstract

Ceratite herpética é uma das mais graves patologias associadas com o vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Ceratite herpética é actualmente a principal causa de cegueira córnea tanto derivados e infecção associada no mundo desenvolvido. Apresentação típica de ceratite herpética inclui infecção do epitélio da córnea e, por vezes, o estroma eo endotélio da córnea profunda, conduzindo a tais patologias corneanas permanentes como cicatrizes, desbaste, e opacidade ^1.

Corneal infecção HSV-1 é tradicionalmente estudada em dois tipos de modelos experimentais. O modelo in vitro, em que as monocamadas de culturas de células epiteliais da córnea são infectadas numa placa de Petri, oferece nível simplicidade, elevado de reprodutibilidade, experiências rápidas, e custos relativamente baixos. Por outro lado, o modelo in vivo, em que os animais, tais como coelhos ou ratos são inoculados directamente na córnea, oferece uma fisiológica altamente sofisticadosistema, mas tem custos mais elevados, experimentos mais longos, cuidado de animais necessário, e um maior grau de variabilidade.

Neste artigo de vídeo, que proporcionam uma demonstração detalhada de um novo modelo ex vivo de corneal epitelial infecção HSV-1, que combina as vantagens de ambos os vitro e em modelos in vivo o. O modelo ex vivo utiliza córneas intactas organotypically mantidas em cultura e infectadas com HSV-1. A utilização do modelo ex vivo permite conclusões altamente fisiologicamente baseados, no entanto, é bastante barato e requer compromisso de tempo comparável à do modelo in vitro.

Protocol

Todos os reagentes e equipamentos foram comprados estéreis ou foram esterilizadas antes do procedimento. Este artigo descreve as etapas de implementação do modelo ex vivo começando com um olho pré-enucleado. Em nossos experimentos, utilizamos frescos olhos inteiros de jovens (8-12 semanas) coelhos albinos (Pel-Freez Biologicals, Rogers, AR). Além disso, usamos córneas humanas obtidos a partir do banco de olhos local. Se realizar a enucleação si mesmo, tome cuidado para não danificar a córnea ou o lim…

Discussion

Neste artigo de vídeo foi descrito um método para o estudo agudo epitelial da córnea infecção por HSV-1 em um modelo ex vivo. Este modelo é um degrau entre a utilidade in vitro e a modelos in vivo, uma vez que permite a validação fisiologicamente precisa dos resultados de cultura de células e, deste modo, limita a quantidade de experimentação animal, que deve ser realizada. Além disso, o modelo ex vivo proporciona uma oportunidade única e valiosa para estudar a i…

Materials

Reagents/Supplies	Company	Catalogue #
Minimum Essential Medium (MEM)	Mediatech	10-010-CV
Non-Essential Amino Acids (100x solution)	Mediatech	25-025-CI
L-Glutamine	Mediatech	25-005-CI
Penicillin G Sodium Salt	Sigma	P3032
Streptomycin Sulfate Salt	Sigma	S9137
Agarose	Invitrogen	15510-027
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Prepared in lab	N/A
Trypsin EDTA (1x)	Mediatech	25-053-CI
DNeasy Blood & Tissue Kit	QIAGEN	69504
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Laemmli Buffer	Prepared in lab	N/A
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	Tissue-Tek	4583
Whole Rabbit Eyes (Young)	Pel-Freez	41211-2
Human Corneas and Whole Eyes	Local Eye Bank	N/A
12 Well Porcelain Spot Plate	Avogadro’s Lab Supply	1877
35 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353001
6 Well Cell Culture Plate	Greiner Bio-One	657160
Cryomold Intermediate	Tissue-Tek	4566