Summary
Bu video yazıda yeni bir kullanımı tarif
Abstract
Herpes keratit, herpes simpleks virüsü tip-1 (HSV-1) ile ilişkili en ciddi patolojilerde biridir. Herpes keratit anda gelişmiş ülkelerde hem kornea kaynaklı ve infeksiyona bağlı körlüğün en önde gelen nedenidir. Herpes keratit Tipik tanıtımı, yara izi gibi kalıcı kornea patolojileri yol açan incelme ve opaklık 1, kornea epitel enfeksiyon ve bazen derin korneal stroma ve endotel içerir.
Kornea HSV-1 enfeksiyonu geleneksel deneysel modellerin iki tipte incelenir. Kornea epitel hücrelerinin kültürlü monolayers bir Petri kabındaki enfekte olduğu in vitro modelin de basitlik, tekrarlanabilirliği yüksek düzeyde, hızlı deneyler ve göreceli olarak düşük maliyeti sunmaktadır. Diğer taraftan, böyle bir tavşan veya fare gibi hayvanlarda kornea direkt olarak inoküle edildiği bir in vivo modeli, en son derece gelişmiş bir fizyolojik sunmaktadırsistem, ancak daha yüksek maliyetler, uzun deneyler, gerekli hayvan bakımı ve değişkenliği daha büyük bir derecesi vardır.
Bu video yazıda, in vivo modeller in vitro ve hem gücünü birleştiriyor kornea epitel HSV-1 enfeksiyonu yeni bir ex vivo modelde, ayrıntılı bir gösteri sunmak. Ex vivo modelde organotypically kültür içinde muhafaza edilmekte ve HSV-1 ile enfekte olan bozulmamış korneası kullanmaktadır. Ex vivo modelinin kullanımı çok fizyolojik açıdan dayalı sonuçlar sağlar, yine de oldukça pahalı değildir ve in vitro model ile karşılaştırılabilir zaman kararlılık gerektirir.
Protocol
Tüm reaktifler ve ekipman steril satın alındığı veya prosedür öncesi sterilize edildi. Bu makalede, bir ön-enüklee gözü ile başlayan ex vivo model kurma adımları açıklanmaktadır. Deneylerde, biz genç (8-12 hft) albino tavşanlar (Pel-Freez Biyolojik, Rogers, AR) taze bütün gözbebekleri kullanın. Ayrıca, yerel göz bankasından elde insan korneası kullanın. Enükleasyon kendiniz yapıyorsanız, işlem sırasında kornea veya limbus zarar vermemek için dikkat edin. Tavşan enükleasyon protokolleri başka 2 bulunabilir.
Bölüm 1: korneoskleral Düğme eksizyonu
- PBS ile gazlı bez, dar bir şerit ıslatın ve işlem sırasında tutarak kolaylaştırmak için göz küresi etrafına sarın.
- Yaklaşık 0.5 cm uzaklıkta limbustan, sklera bir teğetsel kesi yapmak için keskin bir neşter kullanın.
- Kesi uzatmak için keskin bir makas kullanın ve c tamamen tüketimorneoscleral düğmesi.
- Korneoskleral düğmesi izole edildikten sonra forseps ile skleral jant tutarken, iris uzak tease. Endotele zarar veya kornea üzerinde aşırı stres uygulamakla kaçının.
Bölüm 2: Organotipik Kültür içine Kornea Tanıtımı
- Eksplante kornealar Temel Olmayan Amino Asitler (1X), L-Glutamin (2 mM), Penisilin (200 U / ml) ve streptomisin (200 mg / ml) ile desteklenmiş Minimum Essential Medium (MEM) kültüre edilmiştir. Gerekirse örneğin amfoterisin gibi bir antifungal ajan, ayrıca ilave edilebilir.
- 55 ° C'de besiyerine% 1 agaroz çözeltisi hazırlayın ve hazır tutmak
- İyice steril PBS içeren penisilin (200 U / ml) ve streptomisin (200 ug / ml) olarak kornea durulama.
- Steril bir nokta plaka bir kuyuya kornea epitel kısmı aşağı gelecek şekilde yerleştirin.
- Için yeterli miktarda, korneanın endotel çukurluk agaroz içeren ortam eklemetamamen doldurunuz. Agaroz için ~ 1 dk katılaşmasını bekleyin.
- Epitel yüzeyini kapsayacak şekilde 35 mm doku kültürü çanak içine jel iskele epitel tarafı destekleyen ve eklemek besiyeri ile kornea yerleştirin.
- Kornea orta değişiklikleri her 48 saat ile bir hafta boyunca bu şekilde kültüre edilebilir.
HSV-1 enfeksiyonu ve Deneysel Uyuşturucu Tedavi: Bölüm 3
- Bir 35 mm doku kültürü çanağı içine virüs istenen miktarda ihtiva eden orta 1 ml ilave edilir. Biz genellikle zorlanma KOS korneanın başına HSV-1 1x10 4 PFU ile enfekte. Bizim stok titreleri CV-1 mono tabakaları üzerindeki plak deneyleri yapılarak tespit edilir.
- Virüs içeren ortam içine aşağı agaroz iskele epitel kısmı ile birlikte kornea yerleştirin.
- Aralıklı sallanan her 10-15 dakika ile 1 saat enfekte etmek için bir doku kültürü kuluçka makinesi içine kornea yerleştirin.
- 1 saat sonra, virüs-contai aspireorta ning ve herhangi bir kalıntı virüs parçacıkları çıkarmak için PBS ile 2-3 kez yıkayın.
- Geri önceki konumuna kornea yerleştirin ve epitel yüzeyini kapsayacak şekilde taze kültür ortamı ekleyin.
- Deneysel tedavi deney doğasına bağlı olarak, enfeksiyondan önce veya sonra başlatılabilir.
- Kültür ortamı, her 48 saat değiştirilir.
Bölüm 4: Örnek Toplama
- Plak tahlil analizleri için orta. Sıra orta karıştırın ve -80 plaket tahlil veya mağaza için hemen kullanmaya ° C farklı zaman noktalarında örneklerin toplanması halinde daha sonra kullanmak için.
- DNA, RNA ve protein ya da kornea epitel hücreleri
- Agaroz iskele çıkarın ve PBS ile de kornea durulayın.
- Yalnız kornea epitel malzeme sağlamak için kornea dan skleral doku Tüketim halka toplanır.
- Ubir neşter şarkı, izole edilmesi için malzemenin türüne bağlı olarak, uygun bir tampon içinde, kornea epitel hücreleri kazıma. DNA ve RNA izolasyonu için, DNeasy Kan ve Doku Kiti ve RNeasy Mini Kit, sırasıyla (QIAGEN, Hilden, Almanya) kullanın. Protein lizatları toplanması için, Laemmli tampon kullanın. Kornea epitel hücrelerinin akış sitometri analizi için, hücreler tripsin gevşetmek için küçük bir miktar içinde korneaya ön-inkübe edilir ve daha sonra bir bisturi ile tripsin içine bunları çıkarmak. Doku eşit miktarda verim değil kornea epitel kazınması yana, örnekler analiz edilirken uygun kontroller dahil etmek önemlidir. Biz Western blot için bir yükleme kontrol olarak bir referans qPCRs gen ve nucleolin gibi qRT-PCR, GAPDH bir referans transkript olarak 18S rRNA kullanın.
- Immünohistokimya veya immünofloresan için doku örnekleri
- Agaroz iskele çıkarın ve mısır durulamaPBS ile de ea.
- Videoda görüldüğü gibi deneysel hedefe bağlı olarak, parafin doku blok veya dondurulmuş doku blok yapmak için kornea kullanın. Kornea doku bölümleri hazırlanırken Biz standart prosedürleri izleyin.
Temsilcisi Sonuçlar
Doku kültür içinde hücreleri incelemek için mevcut yöntemlerin çoğu kolayca HSV-1 ile enfekte olan ex vivo olarak kornea kullanım için uyarlanabilir. Burada gösterilen HSV-1 enfeksiyonu okuyan uygulanan en yaygın teknikler birkaç temsilcisi sonuçları - qPCR (Şekil 1D), qRT-PCR (Şekil 1B), Western Blot (Şekil 1F), plak testi (Şekil 1C) ve doku immünofloresan (Şekil 1E).
Şekil 1. HSV-1 ex v ile enfekte kornea Analiziivo. Akut kornea epitel HSV-1 enfeksiyonu ex vivo modelde (A) şematik gösterimi. (BF) Bu video makalede anlatılan yöntemi kullanarak enfekte kornealar analizi. Çıkarılmış tavşan korneası suşu KOS HSV-1 1x10 4 PFU / kornea ile enfekte edilmiş ve varlığında (PAA) ya da phosphonoacetic asit (400 ug / ml), HSV replikasyon bilinen bir inhibitör yokluğunda (Mock) içinde kültüre edildi. (B) Toplam RNA, belirtilen zaman noktalarında toplanmıştır ve viral transkripsiyon HSV-1 polimeraz için primerler ile qRT-PCR ile yapılmıştır. 18S karşı Astarlar rRNA bir referans olarak kullanılmıştır. n = 3. Hata çubukları, ortalama ± SEM göstermektedir. (C) Kültür ortamı 48 hpi toplanmıştır ve bulaşıcı parçacık üretim CV-1 mono tabakaları üzerindeki plak deneyi ile değerlendirilmiştir. (D) Toplam DNA 48 hpi toplanmıştır ve viral genom kopyelenmesi değerlendirilmiştir HSV-1 genomu için primerler ile bir qPCR tahlil. PrGAPDH karşı imers referans olarak kullanılmıştır. n = 3. Hata çubukları ± SEM göstermektedir. (E) Mock-işlenmiş kornealar kesitli 48 hpi, at-flaş donmuş ve enfekte epitel içinde bir viral erken protein (ICP8) varlığı için indirekt immunfloresan tarafından analiz edildi. Çekirdekler Höchst 33258 ile zıt edilir. Proteininin (F) lizatları 48 hpi toplandı ve bir viral protein (ICP0) Western blot ifadesi ile değerlendirildi. BCA tahlil örnekleri arasında eşit yükleme sağlamak için kullanılmıştır. hpi = saat sonrası enfeksiyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video yazıda bir ex vivo modelde akut kornea epitel HSV-1 enfeksiyonu çalışmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücre kültürü sonuçlarının fizyolojik-doğru doğrulama için izin verir ve böylece, yapılmalıdır hayvan deneyleri miktarını sınırlar, çünkü bu model, in vivo modeller in vitro ve arasında yararlı bir adım. Buna ek olarak, ex vivo modelde bozulmamış insan kornea epitel herpes enfeksiyonu incelemek için eşsiz ve paha biçilmez bir fırsat sağlar. Bu modeli kullanırken dikkate alınması gereken bazı hususlar aşağıda özetlenmiştir:
- Bu videoyu makalede özetlenen yaklaşım herpes keratit bir model olması gerekiyordu olmadığını vurgulamak önemlidir, ama daha ziyade akut kornea epitel HSV-1 enfeksiyonunun bir modeldir. Herpes keratiti enfeksiyon, enflamasyon ve ev sahibi im gibi çeşitli karıştırıcı süreçlerin bir sonucudurvirüs yanıt Mune. Antijen-spesifik CD4 + ve CD8 + eksplante korneaları bağışıklık sistemi hücreleri tarafından infiltrasyonu tabi değildir çünkü T hücre yanıtlarını bu modelde çoğaltılamaz herpes keratit, patogenezinde önemli bir bileşenidir. Bu nedenle, tipik epitel dendritik ülserler gelişebilir ve klasik herpes stromal keratit 3 gözlenen stromal tutulum eksikliği yok. Bu nedenle, hastalık ciddiyeti ve kornea ülseri floresein görüntüleme puanlama ex vivo modelde mümkün değildir. Buna ek olarak, herpes keratit vakalarının çoğu gecikme viral reaktivasyonu kaynaklanır. Bizim yaklaşım eksojen virüs eksplante kornealar direkt enfeksiyonu dayandığından, akut HSV-1 kornea enfeksiyonu olup reaktivasyon hastalığı modeller. Bu nedenlerden dolayı, burada sunulan örnek hastalığın genel patoloji anlaşılması için uygun değil, daha ziyade sh değilould kornea epitelinde kesinlikle viral replikasyon ve virüs-konak ilişkileri incelemek için kullanılabilir.
- In vitro doku kültürü deneyleri daha fazla değişkenlik ile ex vivo olarak, herpes keratit, örnek sonucu verir. Bu muhtemelen her kornea farklı bir tavşan tahsil edilir ve biraz daha farklı işlenebilir olmasından kaynaklanmaktadır. İnsan korneası bunlar değişken, yaş, ırk ve sağlık durumunun vericilerden kaynaklanan, çünkü tavşan kornealardan daha sonuçlarının daha büyük bir değişkenlik göstermektedir ve zaman postmortem farklı miktarlarda için korunur. Bununla birlikte kullanılması ile deneysel tedavi başına en az beş, korneanın de istatistiksel-güvenilir veri üretmek mümkün olmuştur.
- Kültür Eksplante kornealar 4-5 için geleneksel yöntem korneanın limbus kaplamak için yeterli kültür ortamı kullanarak önerir. Biz, tamamen epitel kapsayacak şekilde orta miktarını artırarak daha tutarlı sonuçlar verdiği bulunduolasılıkla burada yer alan orta ve deneysel ilaçların bireysel kornealar 'erişim arasındaki fark minimize nedeniyle.
- Antikorların kullanıldığı herhangi bir uygulama için tavşan kornea kullanırken, insan, fare, sıçan, vb özelliklerine sahip geleneksel antikorlar tavşan antijenlerine karşı çapraz reaksiyon olasılığı akılda tutmak önemlidir. Ek olarak, tabii ki ikincil anti-tavşan antikorları, bu uygulamada kullanılabilir değildir. Bu nedenlerden dolayı, hücresel hedefler antikor boyama ile ilgili deneyler de insan korneası kullanır.
- Akım sitometri analizi için epitel hücreleri toplarken, deneyci membrana bağlı proteinler tripsin etkileri konusunda dikkatli olmalıdır. Bu nedenle, yüzey proteinlerinin tespiti için, bu gibi kollajenaz ya da olmayan proteazların tripsin gibi hücreler, yerini değiştirmemek diğer araçlar kullanmak yararlı olabilir.
- Herpes keratit Hayvan modelleri ile önce inokülasyon için kornea kazıma güveniyorvirüs. Biz Eksplante kornealar scarifying olmadan enfeksiyon uyumlu seviyelere ulaşmak mümkün olmuştur. Bu büyük olasılıkla gözyaşı filmi ve hızlı bir canlı hayvan kornea yüzeyinden virüsü ortadan kaldırmak olduğunu kırpmadan olmaması nedeniyle.
Ex vivo herpes keratit modeli Potansiyel modifikasyonlar bu video makalede keşfedilmeyi değil:
- Hücre kültüründe ve böyle transfeksiyon, viral teslimat ve gen gunning 6 gibi gen tedavisi araştırma, kullanılan DNA teslimat yöntemleri kullanarak önce HSV-1 enfeksiyonu kornea epitel hücrelerinin genetik modifikasyonu.
- Kullanımı GFP ifade HSV-1 görsel enfeksiyon ölçüde değerlendirmek için 7-8 veya FITC-konjuge anti-HSV antikorları 9-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Delaware Valley Lions Göz Bankası desteğiyle bu iş için çok değerli idi. ICP8 karşı Birincil fare monoklonal antikoru Dr David Knipe (Harvard Tıp Okulu) bir tür hediye oldu. Biz de yararlı tartışmalar ve uzmanlık için Dr Stephen Jennings (Tıp Drexel Üniversitesi) ve Dr Peter Laibson (Wills Göz Enstitüsü) teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
- Kaye, S., Choudhary, A.
- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V.
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
- Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
- Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
- Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).
