Summary
このビデオの記事では、我々は新しいの使用を記述
Abstract
ヘルペス性角膜炎は、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）に関連付けられている最も深刻な病態の一つである。ヘルペス性角膜炎は、現在、先進国の両方の角膜由来と感染関連失明の主要な原因である。ヘルペス性角膜炎の典型的なプレゼンテーションでは、瘢痕のような恒久的な角膜の病理につながる間伐、不透明度1、角膜上皮の感染、時には深い角膜実質と内皮細胞が含まれています。
角膜のHSV-1感染は、伝統的に実験モデルの2つのタイプに研究されている。角膜上皮細胞の単層培養をペトリ皿に感染されているin vitroモデルで 、シンプルさ、再現性の高いレベル、高速実験、比較的低コストを提供しています。一方、このようなウサギやマウスなどの動物が角膜に直接接種されているin vivoモデルで 、高度に洗練された生理を提供していますシステムが、コストが高く、長い実験では、必要に応じて動物の世話、及び変動の大きい程度を持っています。
このビデオの記事では、我々 のin vitroおよび in vivoモデルの両方の長所を組み合わせた角膜上皮のHSV-1感染症の新しいex vivoでモデルの詳細なデモンストレーションを提供する。 ex vivoのモデルはorganotypically培養で維持とHSV-1に感染した無傷の角膜を利用しています。 ex vivoでのモデルの使用は非常に生理的に基づく結論を可能にし、まだそれはむしろ安価で、in vitroモデルに匹敵する時間のコミットメントを必要とします。
Protocol
全ての試薬および機器は滅菌購入したか、前の手順に滅菌した。この記事は、事前除核目で始まるex vivoでのモデルを設定する手順について説明します。私たちの実験では、若い（8-12週）アルビノウサギ（PEL-FREEZバイオ、ロジャーズ、アーカンソー州）からの新鮮な全体の眼球を使用しています。加えて、我々は地元のアイバンクから得られたヒト角膜を使用しています。摘出を自分で行う場合は、手順中に角膜または角膜輪部に損傷を与えないように注意してください。ウサギ摘出プロトコルは別の場所で2見つけることができます。
パート1：角膜強膜ボタンの切除
- PBSでガーゼの狭いストリップを濡らし、手順の間にそれを保持促進するために眼球のまわりでそれを包む。
- 約0.5〜30cm離れ縁から、強膜に切開接線を作るために鋭いメスを使用してください。
- 切開を延長する鋭いはさみを使用してCを完全に切除するorneoscleralボタン。
- 角膜強膜ボタンが切り離されると、鉗子で強膜の縁を押しながら、絞りを離れていじめる。内皮の損傷や角膜に過度のストレスをかけることは避けてください。
パート2：器官型培養角膜への導入
- 植した角膜は非必須アミノ酸（1X）、L-グルタミン（2mM）、ペニシリン（200単位/ ml）およびストレプトマイシン（200μg/ ml）のを補足した最小必須培地（MEM）中で培養される。必要に応じて、例えばアンホテリシンなどの抗真菌剤は、添加することもできる。
- 55℃で培養液中の1％アガロース溶液を調製し、それを準備完了状態に保つ
- 徹底的にペニシリン（200 U / ml）およびストレプトマイシン（200μg/ ml）を含む滅菌PBSで角膜をすすいでください。
- 無菌スポットプレートのウェルに角膜上皮の側を下にして置きます。
- ちょうど十分に角膜内皮凹部にアガロース含有培地を追加完全にそれを埋める。アガロースのために〜1分が凝固することができます。
- 35mmの組織培養皿に支えるゲル足場上皮側で角膜を置き、上皮の表面を覆うように培養液を追加します。
- 角膜は、媒体ごとに変更が48時間で、一週間以上もこのような方法で培養してもよい。
パート3：HSV-1の感染と実験薬による治療
- 35mmの組織培養皿にウイルスの所望の量を含有する培地を1 mlを加える。我々は、通常歪みKOS角膜あたりHSV-1の1×10 4 PFUで感染します。当社の株式価は、CV-1単層上でプラークアッセイを行うことにより決定されます。
- ウイルス含有培地中にアガロース足場上皮側と一緒に角膜を下に置きます。
- 断続的な揺れ15分間隔で1時間感染させるために組織培養インキュベーター中に角膜を置きます。
- 1時間後、ウイルスcontaiを吸引媒体をNingと残留ウイルス粒子を除去するためにPBSで2-3回すすいでください。
- その前の位置に戻して角膜上皮を置き、表面を覆うように新鮮な培地を追加します。
- 実験的な治療法は、実験の性質に応じて、感染前または後に起動されることがあります。
- 培地は48時間毎に変更されています。
パート4：サンプルコレクション
- プラークアッセイ分析のための媒体が。よく培地を混合し、-80℃でプラークアッセイまたはストアにすぐにそれを使う°Cの異なる時点で試料を採取した場合、後で使用するため。
- DNA、RNA、タンパク質、または角膜上皮由来の細胞
- アガロース足場を取り除き、PBSでよく角膜をすすいでください。
- 角膜上皮のみ材料が収集されることを保証するため、角膜から強膜切除する組織のリングを。
- Uメスを歌う、孤立しようとする材料の種類に応じて、適切なバッファに角膜上皮細胞を掻き。 DNAとRNAの単離のために、私たちはそれぞれDNeasyブラッド＆ティッシュキットとRNeasyミニキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用します。タンパク質溶解物の収集のために、私たちはLaemmli緩衝液を使用しています。角膜上皮細胞のフローサイトメトリー分析のために、私たちは細胞を緩め、メスでトリプシンにそれらを取り除くために、トリプシン少量の角膜をプレインキュベートする。組織の同量を得られない角膜上皮をこするので、サンプルを分析する場合に適切なコントロールを含めることが重要です。私達はウェスタンブロット用ローディングコントロールとしてqPCRsで参照遺伝子として定量RT-PCRを、GAPDHで基準転写物としての18S rRNAを使用し、ヌクレオリン。
- 免疫組織化学または免疫蛍光のために組織サンプル
- アガロース足場を取り外して、トウモロコシをすすぐPBSでよくEA。
- 映像に示すように、実験目的に応じて、、パラフィン組織ブロックまたは凍結組織ブロックを作るために角膜を使用しています。角膜組織のセクションを準備するときに我々は標準的な手順に従ってください。
代表的な結果
組織培養中の細胞を研究するための使用可能なメソッドのほとんどは、簡単に、HSV-1 のex vivoに感染して角膜での使用に適合することができます。ここに示されては、HSV-1感染症の研究に適用される最も一般的なテクニックのいくつかのための代表的な結果です-定量PCR（ 図1D）、定量RT-PCR（ 図1B）、ウエスタンブロット（ 図1F）、プラークアッセイ（ 図1C）、および組織免疫蛍光（ 図1E）。
図1。 HSV-1 EX Vに感染して角膜の解析イヴォ。急性角膜上皮HSV-1感染の ex vivo での（a）モデルの概略図。（BF）このビデオ記事で概説された方法を使用して感染した角膜の解析。植したウサギ角膜株KOS HSV-1の1×10 4 PFU /角膜に感染して存在（PAA）またはホスホノ酢酸（400μg/ ml）を、HSVの複製の既知の阻害剤の非存在下（モック）で培養した（B）総RNAを示した時点で収集され、ウイルスの転写は、HSV-1ポリメラーゼのプライマーを用いて、定量RT-PCRによって評価した。 18Sに対してプライマーはrRNAをリファレンスとして使用した。 n = 3とする。エラーバーは±SEMを示す。（C）の培養液を48 HPIで収集され、感染性粒子の産生は、CV-1単層上のプラークアッセイにより評価した。（D）の全DNAを48 HPIで採取し、ウイルスゲノムの複製が評価したHSV-1のゲノムのプライマーを用いた定量PCRアッセイ。 PRGAPDHに対するimersを基準として使用した。 n = 3とする。エラーバーは、区分された、（E）は偽処理角膜を48 HPIで急速冷凍しました。値±SEMを示すものであり、感染した上皮内のウイルス初期蛋白（ICP8）の存在を間接免疫蛍光法により分析した。核はヘーヒスト33258で対比されています（F）タンパク質溶解物を48 HPIで採取し、ウイルスタンパク質（ICP0）の発現をウェスタンブロットにより評価した。 BCAアッセイは、サンプルの等しい負荷を確実にするために使用されていました。 HPI =時間後に感染。
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Discussion
このビデオの記事では 、ex vivo モデルにおける急性角膜上皮HSV-1感染を研究するための方法を説明します。それは細胞培養結果の生理学的に正確な検証を行うことができ、それにより、行わなければならない動物実験の量を制限しているので、このモデルでは、in vivo モデルにおいて、in vitroおよびin間の有用な足がかりです。また、ex vivoのモデルは、無傷のヒト角膜上皮ヘルペス感染症を研究するために、ユニークで貴重な機会を提供しています。このモデルを使用する際に考慮しなければならないいくつかの考慮事項は以下の通りです：
- それは、このビデオの資料に記載されたアプローチがヘルペス性角膜炎のモデルとなることを意図しないことを強調することが重要ではなく、急性角膜上皮のHSV-1感染症のモデルである。ヘルペス性角膜炎は、感染症、炎症、およびホストのIMを含むいくつかの交絡プロセスの結果であり、ウイルスへの応答をMUNE。抗原特異的CD4 +およびCD8 + T細胞応答は、外植角膜は、免疫系の細胞による浸潤の対象にはなりませんので、このモデルでは再現できないヘルペス性角膜炎の発症機序の重要なコンポーネントです。このような理由から、彼らは典型的な上皮樹状潰瘍を発症し、古典的にヘルペス間質性角膜炎3で観察された質の関与を欠いていません。したがって、角膜潰瘍の疾患の重症度およびフルオレセインイメージングの得点と、ex vivoのモデルでは不可能である。また、ヘルペス性角膜炎のほとんどの場合は、待ち時間からウイルスの再活性化によって引き起こされます。我々のアプローチは、外因性のウイルスに外植角膜の直接感染に依存しているので、それは急性のHSV-1角膜感染症ではなく、再アクティベーション病をモデル化します。これらの理由から、ここに提示されたモデルは、疾患の全体的な病理を理解するのに適切ではなく、shをウルドは、厳密に角膜上皮におけるウイルス複製とウイルス - 宿主相互作用を研究するために使用すること。
- in vitro組織培養実験に比べて大きい変動性とex vivoでのヘルペス性角膜炎モデルの収量が得られる。これはおそらく、それぞれの角膜が異なるウサギから収集され、わずかに異なる方法で処理することができるという事実によるものである。人間の角膜は、彼らが可変年齢、人種、健康状態のドナーに由来するので、ウサギの角膜より成果の一層のばらつきを示しており、時間の事後の量が異なるために維持されます。しかし、利用して実験的な治療につき少なくとも5角膜は、我々は、統計的に信頼性の高いデータを生成することができました。
- 角膜は4月5日外植培養するための従来の方法は、角膜の輪部をカバーするだけの十分な培地を使用して示唆している。我々は、完全に上皮をカバーするために媒体の量を増加させると、より一貫性のある結果をもたらすことがわかったそう、そこに含まれる媒体や実験的な薬への個々の角膜のアクセスの違いを最小限にするためである。
- 抗体を利用した任意のアプリケーションのためにウサギの角膜を使用する際には、ヒト、マウス、ラットなどへの特異性を有する従来の抗体は、ウサギの抗原に対する交差反応しない可能性があることに留意することが重要です。さらに、当然の二次抗ウサギ抗体は、これらのアプリケーションでは使用できません。これらの理由から、我々は細胞標的の抗体染色を含む実験では、人間の角膜を使用しています。
- フローサイトメトリー分析のための上皮細胞を採取する際、実験者は、膜結合タンパク質に対するトリプシンの効果については慎重でなければなりません。したがって、表面タンパク質の検出のために、そのようなコラゲナーゼまたは非トリプシンプロテアーゼなどの細胞を、外れの他の手段を使用することが有益かもしれません。
- ヘルペス性角膜炎の動物モデルはで接種前に角膜の乱切に頼るウイルス。我々は、外植角膜をscarifyingずに感染の一貫したレベルを達成することができました。これは、急速に生きている動物で角膜表面からウイルスを排除することを、涙液膜の欠如に起因すると点滅している可能性が高いです。
このビデオ記事で取り上げていないエクスビボヘルペス角膜炎モデルの潜在的な変更：
- そのようなトランスフェクション、ウイルス送達、遺伝子吹き付け6などの細胞培養や遺伝子治療の研究に利用されるDNAの配信方法を使用することによって、前にHSV-1感染に角膜上皮細胞の遺伝子改変。
- GFP発現視覚的に感染の程度を評価するために、HSV-1 7月8日またはFITC結合抗HSV抗体9-10の使用。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
デラウェア州谷のライオンズ·アイバンクのサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。 ICP8に対する一次マウスモノクローナル抗体は、デビッドKnipe（ハーバード大学医学部）から親切な贈り物だった。我々はまた、役立つ議論や専門知識のために博士スティーブンジェニングス（医学ドレクセル大学カレッジ）とピーターLaibson（ウィルズ眼研究所）に感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Mediatech, Inc. | 10-010-CV | |
| Non-Essential Amino Acids (100x solution) | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Penicillin G Sodium Salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Streptomycin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Prepared in Lab | N/A | |
| Trypsin EDTA (1x) | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Laemmli Buffer | Prepared in Lab | N/A | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Whole Rabbit Eyes (Young) | Pel-Freez Biologicals | 41211-2 | |
| Human Corneas and Whole Eyes | Local Supplier | N/A | |
| 12 Well Porcelain Spot Plate | Avogadro’s Lab Supply | 1877 | |
| 35 mm Tissue Culture Dish | Falcon BD | 353001 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Cryomold Intermediate | Tissue-Tek | 4566 |
References
- Kaye, S., Choudhary, A.
- Holmberg, B. J.
- Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
- Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
- Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
- Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V.
- Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
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