Dii-Etikettering van de DRG neuronen om Study Axonale Vertakkingen in een hele berg Voorbereiding van muis embryonale ruggenmerg
Summary
De stereotiepe projecties van de zintuiglijke afferenten in het ruggenmerg knaagdier bieden een gemakkelijk toegankelijk experimenteel systeem om axonale vertakkingen door het opsporen van enkele axonen studie.
Abstract
Hier presenteren wij een techniek om de trajecten van kleine groepen van DRG neuronen label in de embryonale ruggenmerg door diffuse kleuring met behulp van de lipofiele tracer 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DII) 1 . De vergelijking van axonale routes van wild-type met die van de muis lijnen in welke genen gemuteerd kunnen testen voor een functionele rol van de kandidaat-eiwitten in de controle van axonale vertakkingen, die is een essentieel mechanisme in de bedrading van het zenuwstelsel. Axonale vertakkingen in staat stelt een individueel neuron te verbinden met meerdere doelen, waardoor het verstrekken van de fysische basis voor de parallelle verwerking van informatie. Gevolgen bij tussentijdse doelstelling regio's van axonale groei kan worden onderscheiden van terminal arborization. Bovendien kunnen verschillende vormen van axonale tak formatie worden ingedeeld, afhankelijk van de vraag of vertakking resultaten van de activiteiten van de groei kegel (splitsen of vertraagd behanching) of bij het ontluiken van de zekerheden van het axon as in een proces genaamd interstitiële vertakking 2 (afb. 1).
De centrale projecties van de neuronen van de DRG bieden een nuttige experimenteel systeem op beide soorten van axonale vertakkingen studie: als hun afferente axonen bij de dorsale wortel entry zone (DREZ) van het ruggenmerg tussen embryonale dag 10 tot 13 (E10 – E13) zij weer een stereotype patroon van T-of Y-vormige splitsing. De twee resulterende dochter axonen dan verder in rostrale of caudale richtingen, respectievelijk aan de dorsolaterale marge van het koord en pas na een wachttijd collateralen ontspruiten uit deze stam axonen naar de grijze stof (interstitiële vertakking) en het project door te dringen tot relay neuronen in specifieke laminae van het ruggenmerg, waar ze verder arborize (terminal vertakking) 3. Dii traces hebben uitgewezen groei kegels op de dorsale wortel entry zone van het ruggenmerg die leek te zijn in de process van het splitsen van wat suggereert dat bifurcatie wordt veroorzaakt door het splitsen van de groei conus zelf 4 (afb. 2), echter, hebben andere opties besproken en 5.
Deze video toont eerst hoe te ontleden het ruggenmerg van muizen E12.5 het verlaten van de DRG aangesloten. Na fixatie van het monster kleine hoeveelheden van Dii worden toegepast op de DRG met behulp van glas naalden getrokken uit capillaire buizen. Na een incubatie stap, is de gelabelde ruggenmerg gemonteerd als een omgekeerde open boek, voorbereiding op de individuele axonen met behulp van fluorescentie microscopie te analyseren.
Protocol
Discussion
Stereotiepe projectie patronen bestaande uit beide types van axonale tak formatie samen met het gemak van voorbereiding in combinatie met het gebruik van vaste weefsel voor DII etikettering maakt de embryonale ruggenmerg met aangebouwde DRG een gunstige model om te studeren axonale vertakkingen. De toepassing van minieme hoeveelheden van Dii gebruik van gecoat glas naalden laat – in tegenstelling tot het grootste deel etikettering van DRG – het visualiseren van kleine groepen van DRG neuronen en daarmee de analyse van i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Centrum, Berlijn) bedanken voor zijn behulpzame opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door de collaborative research centrum (SFB665) van de Duitse Research Council (DFG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Zeiss | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl–indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O’Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
