Summary

DII-étiquetage des neurones DRG pour l'étude de branchement axonal dans une préparation Mont entiers de souris embryonnaires de la moelle épinière

Published: December 13, 2011
doi:

Summary

Les projections stéréotypée des afférences sensorielles dans la moelle épinière des rongeurs offrent un système facilement accessible à l'étude expérimentale de branchement axonal par le traçage d'axones unique.

Abstract

Nous présentons ici une technique d'étiqueter les trajectoires des petits groupes de neurones DRG dans la moelle épinière embryonnaire par coloration diffusif en utilisant les traceurs lipophiles 1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DII) 1 . La comparaison des voies axonales de type sauvage avec ceux des lignées de souris dont les gènes sont mutés permet de tester un rôle fonctionnel des protéines candidates dans le contrôle des axones de branchement qui est un mécanisme essentiel dans le câblage du système nerveux. Axonale branchement permet un neurone individuel de se connecter avec des cibles multiples, fournissant ainsi la base physique pour le traitement parallèle des informations. Ramifications au niveau des régions objectif intermédiaire de croissance axonale peut être distinguée de l'arborisation terminale. Par ailleurs, différents modes de formation de la branche axonale peuvent être classés selon que les résultats de branchement des activités du cône de croissance (splitting ou soutien-gorge retardéenching) ou à partir du bourgeonnement de collatérales de l'arbre axone dans un processus appelé interstitielle branchement 2 (fig. 1).

Les projections centrales des neurones du DRG offrir un système expérimental utile pour étudier les deux types de branchement axonal: quand leurs axones afférents atteignent la zone de la racine dorsale d'entrée (DREZ) de la moelle épinière entre jours embryonnaires 10 à 13 (E10 – E13), ils afficher un motif stéréotypé de T ou en forme de Y bifurcation. Les deux filles résultant axones ensuite dans des directions rostrale ou caudale, respectivement, à la marge du cordon dorsolatéral et seulement après une période d'attente collatéraux poussent à partir de ces axones souches pour pénétrer la matière grise (interstitiels de branchement) et projet de neurones relais spécifiques lames de la moelle épinière, où ils ont en outre s'arborisent (borne de branchement) 3. Tracés DiI ont révélé des cônes de croissance dans la zone d'entrée des racines dorsales de la moelle épinière qui semblait être dans le processus de fractionnement ce qui suggère que la bifurcation est causée par fractionnement du cône de croissance lui-même 4 (Fig. 2), toutefois, d'autres options ont été discutées ainsi 5.

Cette vidéo montre d'abord comment disséquer la moelle épinière des souris E12.5 laissant le DRG-joint. Suite à la fixation des montants du spécimen minuscule DiI sont appliqués à l'aide d'aiguilles de verre DRG tirée de tubes capillaires. Après une étape d'incubation, le cordon médullaire étiquetés est monté comme un livre ouvert inversé la préparation d'analyser les axones individuels en utilisant la microscopie à fluorescence.

Protocol

1. Procédure de dissection Remarque: l'utilisation expérimentale de la souris doit suivre des directives officiellement approuvées pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Avant la préparation, mettre en place votre loupe binoculaire et à exposer les instruments chirurgicaux nécessaires à la dissection, y compris les ciseaux, grandes et petites, grandes pinces à griffes, pinces courbes et quatre séries de Dumont No.5 dissection pince (don…

Discussion

Schémas stéréotypés de projection comprenant deux types de formation branche axonale en collaboration avec la facilité de préparation en combinaison avec l'utilisation de tissus fixés pour l'étiquetage DiI rend le cordon embryonnaire épinière avec un modèle fixé DRG favorables pour étudier axonale branchement. L'application de quantités infimes de DiI utilisant des aiguilles de verre enduit permet – contrairement à la majeure partie de l'étiquetage DRG – la visualisation des petits groupe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Alistair Garratt (Centre Max Delbrück, Berlin) pour leurs précieux commentaires. Ce travail a été soutenu par le Centre de recherche en collaboration (SFB665) du Conseil allemand de la recherche (DFG).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Stereomicroscope Stemi DRC Zeiss    
Phosphate-buffered solution (PBS) Biochrom AG L182-50  
Paraformaldehyde Merck 8.18715.1000  
Standard surgical scissors Fine Science Tools 14001-13  
Toothed standard forceps Fine Science Tools 11021-14  
Extra fine iris scissors Fine Science Tools 14088-10  
Curved forceps Fine Science Tools 11003-13  
Dumont No.5 fine tips forceps Fine Science Tools 11254-20  
Dumont No.5 mirror finish forceps Fine Science Tools 11252-23  
Vannas-Tübingen spring scissors Fine Science Tools 15008-08  
Filter paper Fisher Scientific FB59041  
Sylgard 184 World Precission Instruments SYLG184  
100-mm Petri dishes Greiner 663102  
12-ml polypropylene tube Carl Roth GmbH ECO3.1  
12-well culture plate Becton Dickinson 35-3043  
Ethanol Merck 1.00983.2500  
Flaming/Brown micropipette puller P-97 Sutter Instrument Co.    
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0066  
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) Sigma-Aldrich 468495  
Microscope slides SuperFrost Plus Carl Roth GmbH H867.1  
Glass cover slips Carl Roth GmbH 1870.2  

References

  1. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
  2. Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
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Cite This Article
Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord. J. Vis. Exp. (58), e3667, doi:10.3791/3667 (2011).

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