マウス胚の脊髄の全載標本での分岐軸索勉強するDRGニューロンのDII -標識
Summary
齧歯類の脊髄への感覚求心性のステレオタイプの予測は、単一の軸索のトレースを通して軸索分岐を研究するために簡単にアクセス可能な実験系を提供する。
Abstract
ここでは、親油性トレーサー1,1' -ジオクタデシル- 3、3,3'、過塩素酸塩（DII）1 3' – tetramethylindocarbocyanineを使用して拡散染色により胚脊髄にDRGニューロンの小グループの軌跡をラベル付けする手法を提案。遺伝子が変異されたマウス系統のものと野生型の軸索経路の比較では、神経系の配線に不可欠な機構である軸索分岐の制御の候補タンパク質の機能的役割をテストできます。軸索分岐は、それによって情報の並列処理のための物理的な基礎を提供する、複数のターゲットに接続する個々のニューロンが可能になります。軸索成長の中間ターゲット領域での影響は、終末分枝と区別されることがあります。また、軸索枝形成の異なるモードが成長円錐の活動（分割または遅延ブラジャーからかどうかの分岐の結果に応じて分類することができるnching）またはプロセスにおける軸索のシャフトから担保の出芽からは、間質分岐2（ 図1）と呼ばれる。
DRGからのニューロンの中央の突起軸索分岐の両方のタイプを研究するために有用な実験系を提供する：それらの求心性軸索は10〜13胚日の間に脊髄の後根のエントリーゾーン（DREZ）に到達（E10 – E13）、それらT -またはY字型の分岐部の紋切り型のパターンが表示されます。得られた2つの娘の軸索は、脊髄の背側縁に、それぞれ、吻側または尾側方向に進むと待機期間の担保は、特定の中継ニューロンに灰白質（間質分岐）とプロジェクトを貫通して、これらの幹の軸索から発芽した後にのみ彼らはさらに樹枝状になる脊髄のラミナ（端子分岐）3。 DIIの追跡機能は、PRにあるように見えた脊髄の後根のエントリーゾーンで成長円錐を明らかにしたその分岐を示唆分割のocessが成長円錐自体4（ 図2）の分割によって引き起こされる、しかし、他のオプションはよく5として議論されている。
このビデオでは、接続されているDRGを残しE12.5マウスの脊髄を分析する方法を第一を示しています。 DIIの試料微量の以下の固定は、キャピラリーチューブから引っ張ってガラスの針を使用して、DRGに適用されます。インキュベーションステップの後、標識された脊髄は、蛍光顕微鏡を使用して、個々の軸索を分析するために反転のオープンブックの準備としてマウントされます。
Protocol
Discussion
DIIラベリングのための固定組織の使用と組み合わせての準備の容易さと一緒に軸索枝の形成の両方のタイプで構成されるステレオタイプ化された投影パターンは分岐軸索の勉強に有利なモデルをDRGの添付を持つ胚脊髄になります。コーティングされたガラスの針を使用してDIIの微量のアプリケーションが可能に – DRGニューロンの小集団の可視化と、それによって個々の軸索とその分岐パ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、有益なコメントを博士アリステアGarratt（マックスデルブリュックセンター、ベルリンの）感謝します。この作品は、ドイツの研究評議会（DFG）の共同研究センター（SFB665）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Zeiss | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl–indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
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