DII-маркировки DRG нейроны по изучению аксонального Ветвление в Всего Подготовка горе мышиных эмбриональных спинного мозга
Summary
Стереотипные проекции сенсорных афферентов в спинном мозге грызунов предлагаем легко доступны экспериментальной системы для изучения аксонального ветвления через отслеживание одного аксонов.
Abstract
Здесь мы представляем технику для обозначения траектории небольших групп нейронов DRG в эмбриональном спинного мозга диффузионного окрашивания использованием липофильных трассирующими 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (DII) 1 . Сравнение аксонального пути дикого типа с теми, мыши строки, в которых гены мутировали позволяет тестирование на функциональную роль кандидата белков в управление аксонального ветвления которых является существенным механизмом проводки нервной системы. Аксонального ветвлений позволяет отдельного нейрона, чтобы соединиться с несколькими целями, обеспечивая тем самым физическую основу для параллельной обработки информации. Ветви на промежуточных целевых регионах в рост аксонов можно отличить от терминала разветвление. Кроме того, различные режимы аксонального формирование отделения могут быть классифицированы в зависимости от того, ветвление результаты деятельности роста конуса (расщепления или задержки бюстгальтерnching) или от начинающего коллатералей от аксона вала в процессе, называемом интерстициальный ветвления 2 (рис. 1).
Центральной проекции нейронов DRG предлагаем полезную экспериментальная система для изучения обоих типов аксонального разветвления: когда их афферентные аксоны достигают спинного зоне корневой записи (DREZ) спинного мозга между эмбриональными дней от 10 до 13 (E10 – E13), они дисплей стереотипные картины Т-или У-образный бифуркации. Два полученных аксонов дочь действовать на ростральной или хвостового направлений, соответственно, на дорсолатеральной краю шнуром, и только после ожидания залогов период прорастают из этих стволовых аксонов проникнуть серого вещества (интерстициальный ветвления) и проект по релейной нейронов в специфических Пластинки спинного мозга, где они дальше ветвиться (терминал ветвления) 3. DII обводка показали рост конусами в спинной зоне корневой записи спинного мозга, который оказался в прocess расщепления предполагая, что бифуркации вызван расщеплением рост сам конус 4 (рис. 2), однако, и другие варианты были обсуждены также 5.
Это видео демонстрирует первые, как рассекают спинной мозг мышей E12.5 оставляя DRG прилагается. После фиксации образца небольшое количество DII применяются для DRG с использованием стеклянных игл вытащил из капилляров. После инкубации, помечены спинного мозга устанавливается в виде перевернутой буквы открытой книги подготовка к анализу отдельных аксонов с помощью флуоресцентной микроскопии.
Protocol
Discussion
Стереотипные проекции включающий оба типа аксонального формирование филиала вместе с простотой подготовки в сочетании с использованием основных тканей для DII маркировки делает эмбрионального спинного мозга с прикрепленными DRG благоприятной моделью для изучения аксонального ветвле…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Алистер Garratt (Дельбрюк центр, Берлин) за полезные комментарии. Эта работа была поддержана совместным исследовательским центром (SFB665) из Немецкого научно-исследовательского совета (DFG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Zeiss | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl–indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O’Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
