Dii-märkning av DRG nervceller att Studera axonal Förgrening i en hel Mount Beredning av Mouse Embryonala ryggmärg
Summary
Den stereotypa projektioner av sensoriska afferenter till gnagare ryggmärgen erbjuda ett lättillgängligt experimentellt system att studera axonal förgrening genom spårning av enskilda axoner.
Abstract
Här presenterar vi en teknik för att märka banor små grupper av DRG nervceller i embryonala ryggmärgen med diffusionsprovtagare färgning med lipofila spårämne 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII) 1 . Jämförelsen av axonal vägar av vild-typ med dem av mus linjer i vilka gener som är muterade kan testa en funktionell roll kandidat proteiner i kontrollen av axonal förgrening vilket är en grundläggande mekanism i ledningar i nervsystemet. Axonal förgrening gör att en enskild neuron att ansluta med flera mål, vilket ger den fysiska grunden för parallell bearbetning av information. Förgreningar till delmål regioner axonal tillväxt kan skiljas från terminalen arborization. Dessutom kan olika typer av axonal gren bildas klassificeras beroende på om förgreningar resultat från verksamheten i tillväxt konen (delning eller försenas behånnching) eller från spirande av säkerheter från axonet axeln i en process som kallas interstitiell förgrening 2 (Fig. 1).
Den centrala projektioner av nervceller från DRG ett användbart experimentellt system för att studera båda typerna av axonal förgrening: när deras afferenta axoner når dorsala zonen roten inträde (DREZ) i ryggmärgen mellan embryonala dagar 10 till 13 (E10 – E13) de visa ett stereotypt mönster av T-eller Y-formade bifurkation. De två resulterande dottern axoner fortsätter sedan i rostralt eller caudal riktningar, respektive vid dorsolaterala marginal på sladden och först efter en väntetid säkerheter Spirande dessa härrör axoner att tränga in i den grå massan (interstitiell förgrening) och projekt för relä nervceller i specifika lamell av ryggmärgen där de ytterligare arborize (plint förgrening) 3. DII tracings har visat tillväxt kottar på dorsala posten zon av ryggmärgen som föreföll vara i process att dela upp tyder på att bifurkation orsakas av uppdelning av tillväxten konen i sig 4 (Fig. 2) har dock andra alternativ diskuterats och 5.
Denna video visar först hur att dissekera ryggmärg från E12.5 möss lämnar DRG bifogas. Efter fixering av provet små mängder av DII tillämpas på DRG med glas nålar dras från kapillärrör. Efter en inkubationstid steg är märkt ryggmärgen monteras som en inverterad öppen bok förberedelse för att analysera enskilda axoner med fluorescensmikroskopi.
Protocol
Discussion
Stereotypa projektion mönster som består av både typerna av axonal gren bildas tillsammans med enkel beredning i kombination med användning av fasta vävnad för DII märkning gör embryonala ryggmärgen med bifogade DRG en gynnsam modell för att studera axonal förgrening. Tillämpningen av små mängder av DII använda belagt glas nålar låter – i motsats till huvuddelen märkning av DRG – visualisering av små grupper av DRG nervceller och därmed analys av enskilda axoner och deras förgrening mönster. Den be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) för värdefulla kommentarer. Detta arbete stöddes av forskningssamarbete centrum (SFB665) av den tyska forskningsrådet (DFG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Zeiss | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl–indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O’Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
