Fare Embriyonik Omurilik Tüm Dağı Hazırlık aksonal dallanma Eğitim DRG Nöronlar DII-Etiketleme
Summary
Kemirgen omuriliğe duyusal aferentlerde kalıplaşmış projeksiyonları tek akson izleme yoluyla aksonal dallanma incelemek için kolay ulaşılabilir bir deneysel sistem sunuyoruz.
Abstract
Burada lipofilik tracer 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', perklorat (DII) 1 3'-tetramethylindocarbocyanine kullanarak uzadıya boyama embriyonik omurilik içine DRG nöronlar küçük gruplar yörüngeleri etiketlemek için bir teknik . Vahşi tip genleri mutasyona uğramış olan fare hatları ile aksonal yollarının karşılaştırma sinir sistemi kablolama önemli bir mekanizmadır aksonal dallanma kontrolü aday proteinlerin fonksiyonel bir rol için test sağlar. Aksonal dallanma ve böylece paralel bilgi işleme için fiziksel bir temel sağlayarak, çoklu hedefleri ile bağlanmak için tek bir nöron sağlar. Aksonal büyüme ara hedef bölgelerdeki etkileri terminali arborization ayırt edilebilir. Ayrıca, farklı mod aksonal şube oluşumu büyüme konisi (bölme ya da geç sutyen olmadığını dallanma sonuçları bağlı olarak sınıflandırılır olabilirnching) ya da bir süreç akson mili teminatların tomurcuklanan interstisyel dallanma 2 (Şekil 1) denir .
Merkezi projeksiyonları DRG nöronların aksonal dallanma iki türlü incelemek için yararlı bir deneysel sistem sunuyoruz: afferent aksonlar 10 13 (E10 – E13) embriyonik gün arasında omurilik dorsal kök giriş bölgesi (DREZ) ulaştığınızda onlar basmakalıp desen T veya Y-şekilli çatallanma görüntüler. Daha sonra çıkan iki kızı aksonlar kablosunun dorsolateral marjı sırasıyla, rostral veya kaudal yönde ilerler ve bir bekleme süresi teminatlar gri madde (interstisyel dallanma) ve proje özel röle nöronlar nüfuz sonra bu kök aksonlar filiz spinal kord lamina daha da (terminal dallanma) 3 arborize. DII iz pr olduğu ortaya çıktı omurilik dorsal kök giriş bölgesi büyüme konileri ortaya koymuşturbu çatallanma düşündüren bölme ocess büyüme konisi kendisini 4 (Şekil 2) bölünmesi sebep olur, ancak, diğer seçenekler de 5 olarak tartışılmıştır var.
Bu video DRG takılı bırakarak E12.5 farelerin omurilik nasıl incelemek için ilk olarak göstermektedir. Kılcal tüpler çıkarılmış cam iğneler kullanılarak DRG DII numune küçük miktarlarda sonra fiksasyon uygulanır. Bir inkübasyon adımdan sonra, etiketli omurilik floresan mikroskobu kullanarak bireysel aksonlar analiz etmek için ters bir açık-kitap hazırlık olarak monte edilir.
Protocol
Discussion
Kalıplaşmış projeksiyon modelleri DII etiketlenmesine yönelik sabit doku kullanımı ile birlikte hazırlık kolaylığı ile birlikte iki tip aksonal şube oluşumu oluşan aksonal dallanma çalışma için uygun bir model DRG bağlı embriyonik omurilik yapar. Kaplı cam iğneler kullanarak DII dakika miktarda uygulama sağlar DRG nöronlar küçük gruplar görselleştirme ve böylece bireysel akson ve dallanma desen analizi – DRG toplu etiketleme aksine. Etiketli nöronlar 8 sayı daha da azalır lip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Alistair Garratt (Max Delbrück Merkezi, Berlin) faydalı yorumları için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Alman Araştırma Kurumu (DFG) ortak araştırma merkezi (SFB665) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Zeiss | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl–indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O’Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
