Summary
簡単な方法は、関連付けられている上皮細胞上の組織線維芽細胞に及ぼす影響を分析するために記述されています。このメソッドは、三次元組織培養の組み合わせにより、3Dから分離後の細胞の分析を容易にすることができます。技術は、腫瘍細胞上の腫瘍関連間質の効果の系統的な研究を可能にする、悪性度を変化させるセルに適用されます。
Abstract
膨大な努力が1-2正常および悪性細胞の行動に関与するシグナル伝達経路や分子を識別するに入っているが、この仕事の多くは、簡単に細胞操作を可能にする古典的な二次元の細胞培養モデルを用いて行われています。それは、細胞内シグナル伝達経路は、次元と3-4セルの表面張力を含む細胞外の力によって影響を受けていることが明らかになった。複数のアプローチがより正確に生物学的組織構造3を表している3次元モデルを開発するためにとられている。これらのモデルは、マルチ次元および建築ストレスを組み込む一方で、細胞への結果の効果の研究は、モデルの限界とその後の分析のために細胞を抽出することの難しさに起因する二次元組織培養で以下容易である。
腫瘍および腫瘍行動における腫瘍周囲微小環境の重要な役割Isはますます4を認識しつつ。腫瘍間質は、複数の種類の細胞と細胞外分子で構成されています。腫瘍の開発中に腫瘍細胞と間質細胞5の間の双方向の信号があります。腫瘍間質共進化に参加するいくつかの因子が同定されているが、体系的に識別し、これらの信号6の完全な配列を研究するための簡単なテクニックを開発する必要性が依然として存在する。線維芽細胞は、正常または腫瘍関連間質組織の中で最も豊富な細胞型であり、成膜と基底膜とパラクリン増殖因子7の維持に貢献しています。
多くのグループは、腫瘍治療への応答、免疫細胞の動員、シグナル伝達分子、増殖、アポトーシス、血管新生および浸潤8月15日を含む様々な細胞機能に線維芽細胞の役割を研究するために三次元培養システムを使用しています。私たちはお尻のために簡単な方法を最適化した混合細胞集団（共培養）16から22の三次元培養を作成するには、市販の細胞外マトリックスのモデルを使用して、乳腺上皮細胞上の乳腺線維芽細胞の影響をディエッシング。共培養を継続した細胞は、主にスフェロイドの外側に内部の線維芽細胞のクラスタリングおよび上皮細胞とスフェロイドを形成し、マトリックス中に多細胞の突起を形成する。変更された上皮細胞の浸潤につながる線維芽細胞の操作が容易に数値および上皮突起23の長さの変化によって定量することができる。さらに、我々は上皮挙動に及ぼす線維芽細胞への暴露の影響の分析を容易に三次元共培養上皮細胞を単離するための方法を考案した。我々は、複数のアッセイを実行するために十分な時間を許可し、共培養の効果は上皮細胞の分離後数週間持続することを発見した。この方法は、細胞への適応可能です悪性度を変化させず、特殊な装置を必要としません。この手法は、複数の条件の下でin vitro細胞モデルでの迅速な評価を可能にし、対応する結果がin vivoでの動物の組織モデルと同様にヒト組織サンプルで比較することができます。
Protocol
1。三次元共培養を確立する
- 共培養を確立する前に、ある日、一晩4℃で冷蔵庫で氷の上で冷凍庫で、解凍からマトリゲルを削除します。
- 実験の日に、使用する上皮細胞の培地に対応する共培養のため培地を準備します（この例ではHMEC培地：10％仔ウシ血清、5μg/ mLのインスリンDME/F12培地1μg/ mLのヒドロコルチゾン、および1 ng / mLのEGF）。マトリゲルと混合する前に氷の少なくとも1時間で培地を保持します。
- 解凍したマトリゲルを希釈し、マトリゲルの合計所望の量を決定します。培地（24ウェルプレートのウェルあたり300μL）と氷上に滅菌チューブに氷冷したHMEC培地の半分をそのボリュームを追加します。その後1:1希釈を達成するためにチューブに解凍マトリゲルの同じハーフの総ボリュームを追加します。チューブを氷上に保持します。
- 場所50マトリゲルのμL：24ウェルプレートのウェル内の指定されたミッドウェル培地混合物と加湿空気および5％CO 2、37℃インキュベーター内で10分間インキュベートする。
- ウェルに培地混合物と別の60分間インキュベート：マトリゲルの追加450μLを追加します。
- インキュベーション中に、0.5×10の濃度で繊維芽細胞（ここでGFPを発現するH-tert-不死削減乳腺線維芽細胞）および上皮細胞（ここではRFPを発現しているH-tert-不死化ヒト乳腺上皮細胞株）の1:1懸濁液を調製HMEC培地0.5mlに5個の細胞それぞれ。
- 60分のインキュベーションステップの後、静かに固化したゲルの一番上に細胞懸濁液をドロップし、インキュベーターに文化を返します。
- 2日間培養を乱すことがありません。この後、培地を非常にゆっくりと井戸の側から培地を吸引し、優しく新鮮なHMEC培地で置き換えることにより、2〜3日ごとに変更することができます。
- 顕微鏡下で毎日のスフェロイド形成を監視することができます。文化は10-14日後に一般的に成熟している。イメージとして光や蛍光顕微鏡を使用して、適切な。回転楕円体のサイズと投影の長さは光学顕微鏡下で測定することができます。
2。共培養スフェロイドの細胞の分離
- 非常に穏やかに、文化をピペットと滅菌ダウン2 mLのガラスピペットを用いて10倍。また、文化をピペットするために、70％エタノールでオートクレーブまたは浸漬により滅菌はさみを使用する1000マイクロリットルプラスチック製のピペットチップの先端を切り落とした。ガラスピペットまたは滅菌15 ml遠心チューブにカットプラスチックピペットチップと室温で2000rpmで5分間遠心分離のいずれかで文化を転送します。携帯スフェロイドは、堆積物下部になります。
- 軽く遠心分離管の上部から中断マトリゲルを削除するには、滅菌パスツールピペットの先端を使用しています。
- 、ペレット化したスフェロイドを1ミリリットルHMEC媒体を追加します。滅菌2mLのガラスピペットで2〜3回ピペッティングし、24ウェルのウェルに文化を転送組織培養プレート。
- スフェロイドは、媒体を変更する前に少なくとも48時間は皿にアタッチすることができます。時間の経過とともに細胞が球状構造を残し、単層として成長します。
- 通過培養細胞を細胞が50％コンフルエントに達する。最初の35 mmディッシュ（約2-4日）に、その後100 mmディッシュ（約3-5日）に文化を展開します。各通過ステップの直前に、手動で可能な限り多くの残留 "ゴーストスフェロイド"として削除するには、滅菌パスツールピペットを使用しています。
- 蛍光細胞選別、必要に応じて、適切な細胞表面マーカー、さらに別の異なる細胞集団を用いて人口純度のフローサイトメトリーで細胞を分析します。必要に応じて分離した細胞は、さらなる分析のために今準備が整いました。
3。代表的な結果
三次元のスフェロイド共培養では、設計されたTiam1サイレンと線維芽細胞は、MAに増加した侵略を誘発する乳腺上皮細胞によるTRIX（ 図1、Dを比較して、E、FからA、B、C）。と線維芽細胞は、Tiam1の過剰発現は、乳癌細胞株SUM159（ 図1、G、H、IにJ、K、Lを比較して）減少して行列の浸潤を誘導する設計。
図2に示すように、一度共培養スフェロイドが確立されているが、細胞集団は、二次元の文脈で再めっきによる回転楕円体から単離することができる。テストセルの相対的な成長率に応じて、純粋な集団は、シリアル通路を通って出てくるかもしれません（ 図3に示すように）、または適切な細胞マーカーを使用してソートすることができます。共培養3Dから分離した後、上皮細胞は、分析のための十分な機会をできるように、長期間にわたって線維芽細胞との共培養により付与されたプロパティを保持します。この例では、Tiam1欠損線維芽細胞への暴露は、数週間持続した共培養HMECsの増加への移行を誘導される3D共培養（ 図4）からFTER分離。
図1光と蛍光顕微鏡下で共培養を確立回転楕円体のイメージング。スフェロイド培養は乳腺上皮細胞と線維芽細胞株を確立し、10〜14日間培養で成長する許可されています。 AF：上皮= HMEC-mCherry細胞。 GL：上皮細胞= SUM159-mCherry細胞。 AC、GI：線維芽細胞=コントロールRMF-GFP細胞。 DF：線維芽細胞= RMF-GFP Tiam1サイレンシングである。 JL：線維芽細胞= RMF-GFP Tiam1過剰発現した。矢印は、マトリックスに侵入上皮突起を示しています。
図2：マトリゲル培養からの分離後の光と蛍光顕微鏡下での文化のシリアルイメージング。 0日目はすぐに分離した後の画像を表します。1日目、25は、分離後の日を示しています。時間をかけて回転楕円体の増加を残して細胞のコロナ。最終的には非常に少数の細胞を用いた "ゴースト"回転楕円体（矢印）のまま。非常に少数のスフェロイドは、ゴーストを除去し、最初の通過した後に残っています。
マトリゲル共培養からの分離後の細胞の図3フローサイトメトリー分析。スフェロイド共培養が成熟した後、細胞をピペッティングし、シリアル継代で3D共培養から分離されています。サンプルのアリコートをフローサイトメトリーによって分析されている（識別するために、緑色蛍光と赤色蛍光を使用して、この例では、GFPを発現するそれぞれの線維芽細胞とmCherryを発現する上皮細胞）が上皮細胞と線維芽細胞の相対的な集団を決定する。
図4。HMECsのトランスウェルの移行がisolati後も持続マトリゲル共培養から上に。純粋な集団を培養または蛍光細胞選別によって得られた後、必要に応じて、細胞を分析することができます。ここでHMECsいずれかのコントロール（C）または穿孔トランスウェル間のTiam1欠損（SHT）線維芽細胞と共培養の移行は、共培養からの分離後、2、4、8週目に評価した。
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Discussion
ここで紹介する方法は、腫瘍細胞を含む上皮細胞に間質性線維芽細胞に及ぼす影響を分析する簡単な方法を表しています。さらに分析するためにマトリックスからの細胞の簡単な抽出を実現しながら、それは、細胞外基底膜マトリックスでサポートされている三次元のコンテキスト内で直接細胞間相互作用が可能になります。線維芽細胞の行が選択および上皮線のシグナル伝達経路に影響を与えるために操作することができるので、これは図1に示すように、侵襲性に変えることができ、腫瘍関連間質の研究に適用することができます。 3D共培養モデルは、細胞の侵襲性の変化が誘導されていることを視覚的に検証が可能になります。アイソレーション·プロトコルは、処理の最小の3D培養からの細胞の抽出を可能にし、セルのプロパティに影響を与える可能性トリプシンまたはマトリックス溶解剤の使用を避けることができます。 3D共培養における線維芽細胞への曝露の影響は後部上皮細胞に固執するその後の分析（ 図4）を容易に3次元共培養からERの分離、。ここに示す例では、細胞遊走への影響を示しながら、2Dで増殖する細胞に適用されるアッセイは、単離された細胞を使用することができます。我々は、関連付けられた乳腺上皮細胞の挙動に線維芽細胞Tiam1発現の変化の影響を分析するためにこのメソッドを使用しています。線維芽細胞におけるTiam1欠乏は、三次元培養および動物腫瘍モデル23の乳腺腫瘍細胞の浸潤や転移を促進します。このメソッドは、私たちは、分子の生化学的、機能的アッセイ（劉Buchsbaum、プレスで）を使用して、潜在的な関与する経路を分析することが可能になりました。
優れた健康で唯一の細胞株を使用し、プロセス中に文化の汚染を防止するために、厳密な無菌操作を遵守することが重要です。最良の結果が早いから細胞よりもむしろ遅れて通路を使用して取得されます（正確な通路数がspecifによって異なりますICは、セルライン）と50-80％コンフルエントの間に密度で採取した細胞から。マトリゲルの正確な処理がプロトコルに従って共培養を確立する前に両方を完全に液化を促進するために、細胞の添加前に行列の徹底した凝固を確保するために鍵となります。行列の不十分な量や固化が文化の中で組織化単分子膜としてではなく、回転楕円体で成長する細胞になります。第一共培養スフェロイドを確立するときに、井の中の最初の50μlのプラグインの配置が均等に分散スフェロイド形成への鍵です、最終的な行列のアンカー固体と、より均一な凝固を可能にします。自動化された細胞選別が混在する集団を分離するために使用する場合は、ポスト絶縁通路の手順ですべてのゴーストスフェロイドの除去が重要である。ここに示す例は、約10 mg / mlのタンパク質組成物とフェノールレッドフリーマトリゲルを使用しています。フェノールレッドフリーの準備は、ASSAの色を検出することができますこのような蛍光としてYS、。
このテクニックは、関連する上皮細胞の腫瘍または逆に関連した線維芽細胞上の腫瘍細胞に及ぼす影響に関する間質性線維芽細胞に及ぼす影響を研究するために細胞タイプの範囲に適用することができます。この手法は、複数の条件の下でin vitro細胞モデルでの迅速な評価を可能にし、対応する結果は、in vivoでの動物の組織モデルと同様にヒト組織サンプルで比較することができます。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
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