Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

Summary

Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.

Abstract

Terwijl de enorme inspanningen zijn gegaan in het identificeren van signaalwegen en moleculen die betrokken zijn in normale en kwaadaardige cel gedrag ^1-2, een groot deel van dit werk is gedaan met behulp van klassieke tweedimensionale celcultuur modellen, die zorgen voor een gemakkelijke cel manipulatie. Het is duidelijk geworden dat de intracellulaire signaalwegen worden beïnvloed door extracellulaire krachten, met inbegrip van dimensionaliteit en cel oppervlaktespanning ^3-4. Meerdere benaderingen zijn genomen om de drie-dimensionale modellen te ontwikkelen die beter biologisch weefsel architectuur ³ te vertegenwoordigen. Hoewel deze modellen zijn voorzien van multi-dimensionaliteit en architectonische stress, studie van de gevolgen daarvan voor de cellen is minder makkelijk dan in de twee-dimensionale weefselkweek te wijten aan de beperkingen van de modellen en de moeilijkheid om het extraheren van cellen voor latere analyse.

De belangrijke rol van de micro-omgeving rondom tumoren in het ontstaan ​​van tumoren en het gedrag van de tumor is steeds opgenomen ^4. Tumor stroma bestaat uit meerdere celtypes en extracellulaire moleculen. Tijdens de ontwikkeling van tumoren zijn er in twee richtingen signalen tussen tumorcellen en stromale cellen ^5. Hoewel sommige factoren die deelnemen aan tumor-stroma co-evolutie zijn geïdentificeerd, is er nog steeds behoefte aan eenvoudige technieken om systematisch te identificeren en de studie van de volledige reeks van deze signalen ⁶ te ontwikkelen. Fibroblasten zijn de meest voorkomende celtype in de normale of tumor-geassocieerde stromale weefsels, en bijdragen aan de afzetting en het onderhoud van basaal membraan en paracriene groeifactoren ^7.

Veel groepen hebben gebruikt drie-dimensionale cultuur systemen om de rol van de fibroblasten op verschillende cellulaire functies, waaronder tumor respons op therapieën, rekrutering van immuuncellen, signaalstoffen, proliferatie, apoptose, angiogenese, en de invasie ^8-15 te bestuderen. We hebben geoptimaliseerd een eenvoudige methode voor ezelkingscapaciteit de effecten van mammaire fibroblasten op mammaire epitheelcellen behulp van een commercieel verkrijgbaar extracellulaire matrix model driedimensionale kweken gemengd celpopulaties (co-culturen) ^16-22 maken. Bij voortgezette co-kweek de cellen vormen sferoïden met fibroblasten clustering in het interieur en epitheelcellen grotendeels op de buitenzijde van de sferoïden en die meercellige uitsteeksels in de matrix. Manipulatie van de fibroblasten die leidt tot veranderde epitheelcellen invasiviteit gemakkelijk kan worden gekwantificeerd door veranderingen in het aantal en de lengte van epitheliale projecties ^23. Verder hebben we een methode ontwikkeld voor het isoleren epitheliale cellen van de drie-dimensionale co-kweek de analyse van de effecten van fibroblast blootstelling op epitheliale gedrag maakt. We hebben gevonden dat de effecten van co-cultuur voor de weken aanhouden na het epitheelcellen isolatie, waardoor ruim de tijd om meerdere tests uit te voeren. Deze methode is aanpasbaar aan cellen vanverschillende maligne potentieel en vereist geen speciale apparatuur. Deze techniek maakt een snelle in vitro evaluatie van celmodellen onder verschillende omstandigheden en de bijbehorende resultaten te vergelijken met in vivo modellen dierlijke weefsels en menselijke weefselmonsters.

Protocol

1. Vaststelling van drie-dimensionale Co-culturen De dag voor tot oprichting van de co-culturen, de Matrigel 's nachts uit de vriezer en dooi op het ijs in een 4 ° C koelkast. Op de dag van het experiment bereiden medium voor co-cultuur, die overeenkomt met het medium voor de epitheliale cellen die (HMEC medium in dit voorbeeld: DME/F12 medium met 10% bovine kalfsserum 5 pg / ml insuline , 1 pg / ml hydrocortisone en 1 ng / mL EGF). Bewaar het medium op het ijs ten minste 1 uur vóór het menge…

Discussion

De hier beschreven methode is een eenvoudige benadering de analyse van de effecten van stroma fibroblasten op epitheliale cellen, waaronder tumor cellen. Het maakt direct cel-cel interacties in een driedimensionale context door extracellulaire matrix basismembraan, terwijl een eenvoudigere extractie van cellen uit de matrix voor verdere analyse. Dit kan worden toegepast op de studie van tumor-geassocieerde stroma, zoals fibroblasten lijnen kan worden gemanipuleerd om signaalwegen keuze en epitheliale lijnen variëren in…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Phenol-red free
Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	ThermoScientific	SH3007303
Insulin	EMD Chemicals	407709	Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter