Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.
Abstract
Muazzam çabaları kolay hücre manipülasyonu için izin klasik iki boyutlu hücre kültür modelleri kullanılarak çok bu işin yapılmıştır normal ve malign hücre davranışları 1-2, yer sinyal yolları ve moleküller girmiş iken. Bu hücre içi sinyal yollarının boyutluluğu ve 3-4 hücre yüzey gerilimi gibi ekstraselüler güçleri tarafından etkilendiğini açıkça ortaya çıktı. Çoklu yaklaşımlar daha doğru biyolojik mimari doku 3 temsil ettiği üç boyutlu modeller geliştirmek için alınmıştır. Bu modeller çok boyutluluğu ve mimari gerilmeler dahil ederken, hücrelere sonuç etkileri çalışma modellerinin sınırlamaları ve sonraki analiz için hücre ayıklanması zorluk nedeniyle iki boyutlu doku kültürü daha az becerikli olduğunu.
Tümörogenez ve tümör davranış tümörlerin yaklaşık mikroçevresinin önemli rol ilar giderek 4 tanınmış oldu. Tümör stromanın birden fazla hücre türleri ve hücre dışı moleküller oluşur. Tümör gelişimi sırasında tümör hücreleri ve stromal hücreleri 5 arasında çift yönlü sinyaller vardır. Tümör stromanın co-evrimi katılan bazı faktörler tespit edilmiş olmasına rağmen, sistematik olarak belirlemek ve bu sinyalleri 6 tam diziyi incelemek için basit bir teknik geliştirmek için hala gereksinim vardır. Fibroblastlar normal veya tümörle ilgili stromal dokularda en bol hücre tipi olup, birikimi ve bazal membran ve parakrin büyüme faktörleri 7 bakım katkıda bulunmaktadır.
Birçok grup tümör tedavilere yanıt, bağışıklık hücrelerinin işe alma, sinyal molekülleri, proliferasyon, apoptoz, anjiyogenez ve işgali 8-15 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları üzerinde fibroblast rolünü incelemek için üç boyutlu kültür sistemleri kullanılmıştır. Biz eşek için basit bir yöntem optimizekarışık hücre popülasyonlarının (co-kültür) 16-22 üç boyutlu kültür oluşturmak için piyasada bulunan hücre dışı matriks modeli kullanılarak meme epitel hücreleri üzerinde meme fibroblastların etkileri Essing. Devam ko-kültür ile hücrelerin iç fibroblastlar kümeleme ve büyük ölçüde parçacıklarının dış ve matriks içine çok hücreli çıkıntılar oluşturan epitel hücreleri ile sferoidler oluştururlar. Değişmiş epitel hücre invaziv yol açar fibroblastların Manipülasyon kolayca numaraları ve epitel projeksiyonları 23 uzunluğu değişiklikler ile belirlenebilir. Dahası, epitel davranışı üzerindeki fibroblast maruz etkileri analizi kolaylaştırır, üç boyutlu bir ko-kültür epitelyal hücreleri izole etmek için bir yöntem geliştirmişlerdir. Biz ortak kültürün etkileri birden fazla testleri gerçekleştirmek için yeterli zaman tanıyarak, epitel hücre izolasyonu haftalar sonra devam bulduk. Bu metod ile hücrelerin uyarlanabilirmalign potansiyeli değişen ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Bu teknik birden koşullar altında in vitro hücre modellerinde hızlı değerlendirme için izin verir, ve karşılık gelen sonuçları in vivo hayvan doku modelleri yanı sıra, insan doku örneklerine göre olabilir.
Protocol
Discussion
Burada anlatılan yöntem tümör hücreleri dahil olmak üzere, epitel hücreler, üzerine stromal fibroblastlann etkileri analiz için basit bir yaklaşım temsil eder. Daha fazla analiz için matristen hücrelerin kolaylıkla ekstraksiyon sağlarken Bu, hücre dışı bazal membran matris tarafından desteklenen bir üç-boyutlu bağlamında doğrudan hücre-hücre etkileşim için olanak sağlar. Bu fibroblast hatları tercih ve epiteliyal hatları Şekil 1 'de gösterildiği gibi, invaziv potan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | ThermoScientific | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | ThermoScientific | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Chemicals | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L. Tumor-stroma interactions. Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 97-101 (2005).
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
