Isolement des cellules épithéliales mammaires à partir de trois dimensions de cellules mixtes Sphéroïde Co-culture

Summary

Une méthode simple est décrite pour analyser les effets de fibroblastes de tissus sur les cellules épithéliales associées. La combinaison de cette méthode et la culture de tissus en trois dimensions peut faciliter l'analyse des cellules après l'isolement de la 3D. La technique est applicable à des cellules plus ou moins de potentiel malin, permettant l'étude systématique des effets de associé à une tumeur du stroma sur les cellules tumorales.

Abstract

Bien que des efforts énormes ont été consacrés à l'identification des voies de signalisation et des molécules impliquées dans les comportements de cellules normales et malignes ^1-2, une grande partie de ce travail a été fait à l'aide classique en deux dimensions des modèles de culture de cellules, qui permettent de la manipulation des cellules facile. Il est devenu clair que les voies de signalisation intracellulaires sont touchés par les forces extracellulaires, y compris la dimensionnalité et la tension superficielle de cellules ^3-4. De multiples approches ont été prises pour développer des modèles tridimensionnels qui représentent plus précisément l'architecture des tissus biologiques ^3. Bien que ces modèles intègrent multi-dimensionnalité et les contraintes architecturales, l'étude des effets conséquents sur les cellules est moins facile que dans la culture de tissus à deux dimensions en raison des limites des modèles et de la difficulté à extraire des cellules pour une analyse ultérieure.

Le rôle important du microenvironnement autour des tumeurs dans la tumorigenèse et le comportement de tumeur is de plus en plus reconnue ^4. Stroma tumoral est composé de plusieurs types de cellules et molécules extracellulaires. Au cours du développement tumoral il ya des signaux bidirectionnels entre les cellules tumorales et les cellules stromales ^5. Bien que certains facteurs participant à la tumeur du stroma co-évolution ont été identifiés, il ya encore un besoin de développer des techniques simples à identifier systématiquement et d'étudier l'éventail complet de ces ⁶ signaux. Les fibroblastes sont les cellules les plus abondantes dans normales ou associé à une tumeur des tissus stromales, et de contribuer au dépôt et à l'entretien de la membrane basale et les facteurs de croissance paracrines ^7.

De nombreux groupes ont utilisé trois systèmes de culture dimensions pour étudier le rôle des fibroblastes sur diverses fonctions cellulaires, y compris la réponse tumorale aux traitements, le recrutement de cellules immunitaires, des molécules de signalisation, la prolifération, l'apoptose, l'angiogenèse et l'invasion ^8-15. Nous avons optimisé une méthode simple pour le culesser les effets de fibroblastes mammaires sur les cellules épithéliales mammaires en utilisant un modèle de matrice extracellulaire disponible dans le commerce pour créer des cultures tridimensionnelles de populations de cellules mixtes (co-cultures) ^16-22. La co-culture avec des cellules suite former des sphéroïdes avec le regroupement des fibroblastes à l'intérieur et les cellules épithéliales largement à l'extérieur des sphéroïdes et formant multicellulaires saillies dans la matrice. Manipulation des fibroblastes qui mène à invasivité des cellules altérées épithéliale peut être facilement quantifié par des changements dans le nombre et la durée des projections épithéliales ^23. En outre, nous avons mis au point une méthode pour isoler les cellules épithéliales sur trois dimensions de co-culture qui facilite l'analyse des effets de l'exposition sur le comportement des fibroblastes épithéliale. Nous avons constaté que les effets de la co-culture persister pendant des semaines après l'isolement de cellules épithéliales, ce qui permet amplement de temps pour effectuer des essais multiples. Cette méthode est adaptable à des cellules devariant potentiel malin et ne nécessite aucun équipement spécialisé. Cette technique permet une évaluation rapide des modèles cellulaires in vitro dans des conditions multiples, et les résultats correspondants peuvent être comparés à des modèles in vivo de tissus animaux ainsi que des échantillons de tissus humains.

Protocol

1. L'établissement en trois dimensions co-cultures Le jour avant d'établir des co-cultures, retirez le Matrigel du congélateur et le dégel de la glace dans un 4 ° C réfrigérateur pendant la nuit. Le jour de l'expérience, pour préparer le milieu de co-culture, qui correspond à la moyenne pour les cellules épithéliales à être utilisés (moyenne HMEC dans cet exemple: DME/F12 milieu avec 10% de sérum bovin veau, 5 pg / ml d'insuline , 1 ug / ml d'hydrocortisone et 1 n…

Discussion

La méthode présentée ici représente une approche simple pour analyser les effets des fibroblastes du stroma sur les cellules épithéliales, y compris les cellules tumorales. Il permet de directement l'interaction cellule-cellule dans un contexte tridimensionnel pris en charge par la matrice extracellulaire de la membrane basale, tout en permettant une extraction facile des cellules de la matrice pour une analyse plus approfondie. Cela peut être appliqué à l'étude de associé à une tumeur stroma, comme …

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Phenol-red free
Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	ThermoScientific	SH3007303
Insulin	EMD Chemicals	407709	Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter