المشعة في الموقع التهجين، لتحديد متنوعة أنماط التعبير الجيني في الأنسجة

Summary

ويستخدم بنجاح هذا البروتوكول للكشف عن كميا المستويات والأنماط المكانية التعبير مرنا في أنواع الأنسجة متعددة عبر أنواع الفقاريات. يمكن للطريقة الكشف عن النصوص وفرة منخفضة، وتتيح معالجة مئات من الشرائح في وقت واحد. نقدم هذا البروتوكول باستخدام التنميط التعبير عن الطيور تشكيل المخ الجنينية كمثال على ذلك.

Abstract

معرفة توقيت، مستوى، توطين الخلوية، ونوع من الخلايا التي يتم التعبير عن الجينات في يساهم في فهمنا للعمل الجين. ويمكن تحقيق كل هذه الميزات مع التهجين في الموقع لmRNAs داخل الخلايا. هنا نقدم مشعة في طريقة التهجين في الموقع معدلة من كلايتون وآخرون (1988) ⁽¹⁾ التي كانت تعمل بنجاح في المختبر لسنوات عديدة، وخاصة بالنسبة للأدمغة الفقاريات الكبار ^2-5. منذ فترة طويلة تكميلية الحمض النووي الريبي (كرنا) تحقيقات للتسلسل الذي يسمح للكشف عن الهدف من وفرة النصوص منخفض ^6،7. إدماج النيوكليوتيدات المشعة في تحقيقات كرنا يسمح لحساسية الكشف عن مزيد من المحاضر وفرة منخفضة، والتحليل الكمي، إما عن طريق ضوء فيلم الأشعة السينية الحساسة أو مستحلب المغلفة على الأنسجة. هذه طرق الكشف توفير سجل طويل الأمد من التعبير الجيني الهدف. مقارنة مع المنهجيات مسبار غير المشعةالمواد المستنفدة للأوزون، مثل مجموعة دبي للاستثمار ووضع العلامات، وتهجين مسبار المشعة الأسلوب لا يتطلب خطوات التضخيم متعددة باستخدام HRP-الأجسام المضادة و / أو عدة TSA للكشف عن النصوص وفرة منخفضة. لذلك، وهذه الطريقة توفر وجود علاقة خطية بين كثافة إشارة والمبالغ المستهدفة مرنا للتحليل الكمي. لأنها تتيح معالجة 100-200 الشرائح في وقت واحد. كان يعمل بشكل جيد لمراحل النمو المختلفة للأجنة. معظم الدراسات التنموية في التعبير الجيني استخدام الأجنة كلها والنهج غير المشعة ^8،9، وذلك جزئيا بسبب الأنسجة الجنينية هي أكثر هشاشة من أنسجة البالغين، مع أقل التماسك بين الخلايا، مما يجعل من الصعب معرفة الحدود الفاصلة بين سكان الخلية مع المقاطع النسيجية. في المقابل، نهجنا المشعة، ونظرا لنطاق أكبر من الحساسية، غير قادرة على الحصول على أعلى تباين في القرار في التعبير الجيني بين المناطق الأنسجة، مما يجعل من الاسهل لمعرفة الحدود الفاصلة بين السكان. باستخدام هذه الطريقة، يمكن للباحثين الكشف عنأهمية ممكن من الجينات التي تم تشخيصها حديثا، وتوقع مزيد من وظائف الجينات في المصالح.

Protocol

1. تحضير الأنسجة حصاد أنسجة جديدة. للأجنة الطيور، وفتح بعناية البيض وتنظيف الجنين في صحن مع 1xPBS، مرتين. لأدمغة البالغين، وإزالة بسرعة الدماغ وغسل بلطف مع PBS × 1. تضمين الأجنة أو البالغين الى الدماغ العفن جزءا لا يتجزأ من نسيج كامل من أكتوبر تك، ويوجه النسيج حسب الحاجة لباجتزاء، وتجميد بسرعة الكتلة عن طريق وضعها في الإيثانول وجاف خليط الجليد، والحرص على عدم الحصول على خليط من داخل كتلة . شريحة العينة المجمدة في ناظم البرد إلى أقسام 10-12 ميكرون سميكة. لأنسجة المخ والجنينية، أفضل القطع المعتدلة هو ضمن مجموعة من -18 درجة مئوية إلى -20 درجة مئوية. تحميل المقاطع المجمدة على شرائح سوبر بلس الزجاج. تخزين المقاطع في مربع الشرائح على -80 درجة مئوية. 2. جيل من Riboprobes المشعة (استخدم إجراءات السلامة من الإشعاع من مؤسستكم) إنشاء DN تنقية خطيقالب من [كدنا] اهتمامك إما عن طريق أنزيم هضم محدود من جزء المستنسخة التي تحيط بها مواقع المروج RNA بوليميريز من البلازميد أو بواسطة PCR لإدراج تعلق على مروج مواقع بوليميريز الحمض النووي الريبي ملزمة. ومن الممكن أيضا لتوليد شظايا PCR مع المروجين بوليميريز الحمض النووي الريبي كجزء من (3)، 'و 5' بادئات PCR. تنقية المواد الهلامية الخاصة بك مقيدة أو PCR الشظايا الناتجة مع عدة هلام تنقية GENECLEAN. إلى أنبوب 0،5 مل إيبندورف، إضافة 0،5-1 ميكروغرام من تنقية خطي قالب الحمض النووي، وعازلة النسخ، DTT، RNasin، AGC حل مزيج النوكليوتيدات، وريبونوكلياز المياه مجانا لتقديم ما يصل الى حجم المبلغ المطلوب. ثم يضاف S 35-UTP وبوليميريز الحمض النووي الريبي المناسبة لجعل إما بواسطة العقاقير أو إحساس riboprobes. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة في حمام ماء C ° 37. إضافة آخر قسامة من بوليميريز الحمض النووي الريبي واحتضان لمدة ساعة 1. إضافة 3M حل خلات الصوديوم (0.1 أضعاف من الحجم الكلي) و 100 EtOH٪ (2.5 FOدينار من اجمالي حجم) في أنبوب إيبندورف لترسيب الحمض النووي الريبي riboprobe توليفها. احتضان في الثلج الجاف أو -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو أكثر من 3 ساعات لمساعدة هطول الأمطار. بيليه RNA بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية و 15،000 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي إيبندورف فوق المنضدة لمدة 30 دقيقة. إزالة طاف ويغسل بيليه مع EtOH 70٪، مع الاستفادة من إصبع لخلط بيليه أيضا. بيليه RNA مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 15000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. إزالة طاف تماما من قبل pipeting ثم إضافة 40 حل التهجين ميكرولتر. مزيج جيد من قبل pipeting داخل وخارج. وضع 1 ميكرولتر من الحل إلى 3 حل السلامة، حل مل في مزيج التلألؤ، قارورة جيدا، وقياس التهم في عداد التلألؤ. وضع إيبندورف مع riboprobe في -20 درجة مئوية للاستخدام في غضون أسبوع واحد. 3. معالجة الأنسجة في غطاء محرك السيارة، وإعداد برنامج تلفزيوني جديد مخزنة paraformaldehy 4٪دي حل لحوالي 3-5 درجة مئوية فوق درجة حرارة الغرفة. الشرائح في الفترة من -80 درجة مئوية تخزين في رفوف معدنية على الثلج الجاف، والقيام بالعمل الفضاء تحت غطاء محرك السيارة، ثم وضع رف في حل بارافورمالدهيد 4٪، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني × 1 نحو 15 الانخفاضات كل (حوالي 1 ثانية لكل DIP). في غطاء محرك السيارة، وجعل العازلة أستلة والتخلص منه بقوة في غضون 10 ثانية. صب مباشرة في علبة تحتوي على رف من الشرائح واحتضان لمدة 10 دقيقة، للحد من خلفية ملزم من riboprobe. شطف 3 مرات في SSPE × 2 لمدة 15 الانخفاضات. يذوى في 70٪، 95٪ و 100٪ مسلسل EtOH لمدة 2 دقيقة في كل خطوة (ليس من الضروري أن يكون في غطاء محرك السيارة). تجف الشرائح تحت غطاء محرك السيارة ما لا يقل عن 10-15 دقيقة. 4. تهجين حساب كمية من riboprobe (0.5-1 × 10 6 حرف في الدقيقة لكل شريحة) وحل التهجين (100 ميكرو لتر لكل شريحة) اللازمة لكافة الشرائح. قبلتسخين مزيج riboprobe-تهجين إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد riboprobe. الماصة 100 ميكرولتر من riboprobe-تهجين حل في خط عبر الشريحة، واستخدام الزجاج ساترة لنشره وتعميمه بالتساوي على الأنسجة وساترة. مكان الشرائح أفقيا، التي تواجه تستقيم في رف معدني ورف مكان تستقيم ببطء إلى 65 درجة مئوية لمدة حمام الزيت ما لا يقل عن 4 ساعات وبحد أقصى 16 ساعة. النفط يخلق ختم محكم حول coverslips. إزالة رفوف معدنية من حمام الزيت والقضاء على فائض من النفط في جميع أنحاء رف مع المناديل الورقية. يغسل النفط من الشرائح المشمولة ورف معدني في صواني الزجاج أو المعادن التي تحتوي على الكلوروفورم، مرتين. ويمكن استخدام ال 2 الثانية والكلوروفورم غسيل كأول للتجربة القادمة. نقل رف مع الشرائح المشمولة في صينية مع 0.1٪ في β-المركابتويثانول + 2 حل SSPE x وتتحرك صعودا وهبوطا لبعض الانخفاضات لتخفيف وإزالة coverslips حل التهجين الزائدة حتىشفويا. نقل رف مع الشرائح المشمولة في حل الطازجة بنسبة 0.1٪ β-المركابتويثانول + 2 × SSPE، ومن ثم إزالة coverslips مع ملقط ريبونوكلياز الحرة في الحل لمنع الخدش المقاطع النسيجية. نقل الشرائح المكشوف إلى رف جديدة في علبة أفقي الشريحة حامل رف، في حل من 0.1٪ β-المركابتويثانول في SSPE × 2. احتضان رف مع الشرائح في الطازجة بنسبة 0.1٪ المركابتويثانول-β + 2 × SSPE حل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لازالة الزائدة غير منضم RNA التحقيق. تجاهل هذه السابقة وحلول غسيل مائي، وكذلك coverslips، والنفايات المشعة. نقل رف مع الشرائح في التوصل إلى حل prewarmed SSPE 2X على 65 درجة مئوية، إضافة β-المركابتويثانول إلى النهائي للتركيز 0.1٪، واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تجاهل مثل النفايات المشعة. نقل واحتضان رف مع الشرائح مرتين في prewarmed SPPE X 0.1 عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لكل منهما. كمية النشاط الإشعاعي إزالةفي هذه الخطوة صغيرة جدا وأنه لم يعد يعتبر النفايات المشعة المفرطة بعد هذه الخطوة. يذوى رف والشرائح في 70٪، 95٪ و 100٪ للEtOH 2 دقيقة لكل منهما. تجفيف الشرائح في غطاء محرك السيارة ما لا يقل عن 30 دقيقة. 5. تصور من الإشارة المشعة وضع الشرائح الجافة في شريط الفيلم وفي غرفة مظلمة، ووضع فيلم الأشعة السينية (كوداك BioMax MR فيلم) على الشرائح، وأغلق الكاسيت. تأكد من أن الشرائح التي تواجه الجانب مستحلب للفيلم الأشعة السينية. كشف الشرائح للأيام 1-7 ~ اعتمادا على وفرة من المتوقع للمحاضر. وضع فيلم الأشعة السينية في تطوير مستوى والمثبت. إشارة التهجين كما يظهر أسود (تتعرض الحبوب الفضية في مستحلب) عن فيلم (الشكل 1). (اختياري) لتحديد قرار الخلوية ويرى إشارة على الأنسجة، والشرائح تحتاج إلى تراجع في مستحلب التصوير الفوتوغرافي وcounterstaineد. إذا كنت تسير على ملون مباين في نهاية المطاف مع البنفسجي cresyl، delipidize ثم المقاطع التي تفرخ في الزيلين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مرتين، ترطيب 1 دقيقة في كل 100٪، 100٪، 95٪، 95٪، 70٪، و 50٪ EtOH وبعد ذلك في ماء منزوع الأيونات. إذا كنت لا ترغب في الذهاب الى وصمة عار مع صبغة التي لا تتطلب delipidization، ثم delipidization ليست ضرورية. الشرائح الجافة بشكل جيد تحت غطاء محرك السيارة ما لا يقل عن 2-3 ساعات. في غرفة مظلمة باستخدام ضوء آمنة ويستخرج ما يكفي من كوداك مستحلب حظر التجارب النووية لتغطية نصف الشريحة بالطول (أي نسيج) في وعاء زجاجي غمس، ثم تذوب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. تمييع ثم بالماء المقطر إلى نسبة 1:1. وينبغي على مستوى مستحلب تغطي الآن جميع المقاطع على شريحة عند تراجع الشريحة في ذلك. إذا كان لديك الكثير من الشرائح، قد تحتاج إلى تحضير مستحلب اضافية. تراجع الشرائح في مستحلب المخفف في 42 ° C حمام المياه والشرائح انخفض الجافة في ضوء حاوية مغلقة overn ضيقight في غرفة مظلمة، أو في فرن عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات، مع الأنوار. نقل الشرائح في فتحات الرفوف في الصناديق السوداء التي تحتوي على desiccators، والحرص على عدم لمس الشرائح بعضها البعض وبالتالي خلق الأعمال الفنية. ختم حواف المربعات مع شريط أسود الكهربائية ببطء لمنع الشرر ضوء ثابت بفعل ثم التفاف مربعات في رقائق الألومنيوم. تخزين صناديق في 4 درجات مئوية من عدة أيام إلى أسابيع (إشارة من 1 يوم في فيلم الأشعة السينية مشابهة لمدة 5 أيام تحت مستحلب). تسخين صناديق الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. في غرفة مظلمة، وإزالة رف مع الشرائح (أو الشرائح مكان في رفوف معدنية في حالة استخدام مربعات مع فتحات الشريحة) من مربعات وتطويرها في المطور كوداك D-19 في 16 درجة مئوية لمدة 3.5 دقيقة. غسل الشرائح المتقدمة في مياه الحنفية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. احتضان الشرائح مرتين في يتدخل في 19 درجة مئوية لمدة 6 دقائق لكل منهما. ويمكن تشغيل الأضواء عليها خلال حضانة يتدخل ثانية. </لى> غسل الشرائح في المياه الجارية في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة، وتتخلص من مستحلب من الجانب الخلفي من شريحة في حين أن 'الرطب' بشفرة حلاقة لمنع خدش الزجاج. وصمة عار الأنسجة مع البنفسجي cresyl 0.3٪ في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق. غسل اضافية حل البنفسجي cresyl في ماء الصنبور جديدة لالانخفاضات 15 ~. يذوى الشرائح عن الانخفاضات 15 ~ في كل حل الكحول: 50٪، 70٪، 95٪، 95٪، 100٪ و 100٪ EtOH. احتضان الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مرتين. ساترة مع متوسط ​​Permount على الشريحة وتجفيف الشريحة المشمولة في غطاء محرك السيارة بين عشية وضحاها (> 16 ساعة)، وسوف يستغرق عدة أيام قبل الغراء هو قوي بما فيه الكفاية لتنظيف شرائح أخرى. 6. توليد الصور الملونة بمجهر ذي ساحة مظلمة إذا، من الضروري مواصلة نظيفة مستحلب الزائد على الجزء الخلفي من الشرائح (غير coversliped جانب دون الأنسجة) عن طريق تبليل مع الماء وتجريف بشفرة حلاقة. شطف شرائح مع حل EtOH 80٪ والقضاء 1-2 مرات بلطف للتخلص من الحطام والغبار. التقاط الصور تحت الساحة المظلمة أو إضاءة brightfield. قد الخطوات 6.2 و 6.3 يجب أن تتكرر 2-3 مرات من أجل الحصول على صور جيدة من دون جزيئات الغبار، التي ينظر اليها بسهولة في الساحة المظلمة تحت المجهر تشريح. 7. ممثل النتائج وطريقتان رئيسيتان لمشاهدته في نتائج التهجين في الموقع على أقسام الأنسجة تهجين مع تحقيقات 35 S المشعة: 1) فيلم الأشعة السينية التي تم وضعها فوق الشرائح أو 2) مستحلب التي تم المغلفة على الشرائح. وثمة نهج ثالث هو استخدام شاشة phosphorimager وضعت على الشرائح، ولكن لم يتم ونحن راضون عن قرار من هذا النهج. أفلام الأشعة السينية تقديم نتيجة سريعة وتحليلات للحالة العامة للتهجين. الأشعة السينية بيانات الفيلم يكشف أيضا قرار تشريحية واسعة ويمكن أن تستخدم في الشرج كميysis 10. أمثلة من الصور فيلم الأشعة السينية في وقت متأخر من رؤساء جنين الطيور المهجنة مع تحقيقات العقاقير عن التعبير الجيني FoxP1 وCoupTF2 في 1A أرقام وباء. كل الجينات وفيرة للغاية في تقسيمات محددة في الدماغ. وينبغي أن يكون نتيجة جيدة جودة فيلم الأشعة السينية تكون حادة (لا ضبابية) وتحتوى على نسبة عالية إشارة إلى نسبة خلفية. ويمكن لعدم وضوح الصورة يكون راجعا إلى جهة الاتصال غير المتكافئ بين فيلم الأشعة السينية، وشريحة زجاجية مع النسيج المهجنة. للشرائح مستحلب انخفض، ومستحلب يحتوي على ضوء أملاح الفضة الحساسة المغلفة على النسيج كما apposed إلى كونه على البلاستيك من فيلم الأشعة السينية. خلال النامية، ويتم تحويل 35-S أملاح الفضة تتعرض لمعدنية من الفضة والحبوب، مثل الكثير في فيلم الأشعة السينية. ومع ذلك، فإن ودائع الفضة مرئية مباشرة على الخلايا التي تمثل التعبير الجيني التي يمكن ملاحظتها وقياسها نوعيا تحت المجهر. الحبوب فضي لامع منع مباشرة مارا ضوءساعة وتظهر النقاط السوداء تحت رأي brightfield. وملون مباين البنفسجي cresyl يظهر اللون الأرجواني في (الشكل 3A، 3C، و 4 الشكل). في الساحة المظلمة، وحبيبات الفضة تعكس الضوء القادمة من جانب، وتبدو كأنها بقع بيضاء (الشكل 1C، 1D، 3B و 3D). في هذه الحالة، البنفسجي cresyl صمة عار يظهر أحمر اللون. في brightfield، في إشارة التهجين هو أسهل لعرض تحت التكبير العالية في قرار الخلوية، في حين أنه في الساحة المظلمة، وبالإضافة إلى ذلك، يمكن النظر إلى إشارة تهجين تحت أدنى التكبير على النسيج كله. وجهة النظر الساحة المظلمة هو النهج الذي عادة ما تستخدم لإظهار نمط التعبير الجيني عموما. ومع ذلك، بالنسبة الى نتيجة سريعة تم الحصول عليها من صور الأشعة السينية، الشرائح مستحلب انخفض يستغرق وقتا أطول وقت (واحد إلى عدة أسابيع)، وأكثر حساسية إلى الحصول على معلومات أساسية. هناك أربعة مصادر مشتركة من خلفية قوية: 1) الخلفية في جميع أنحاء فيلم الأشعة السينية وعادة ما تفعل تيس مشاكل مع المطور أو يتدخل، أو يتعرض الفيلم جزئيا، 2) الخلفية على الشرائح الزجاجية عادة ما يكون بسبب مشاكل مع إعداد الشريحة أو غسل الزجاج، مثل silination غير لائق من الشرائح من مصدر تجاري أو النفس المعدة؛ 3) تعرض مستحلب والخلفية التنمية؛ و 4) على خلفية مقطع إما بسبب عدم وجود دقيق خطوات الغسيل بعد التهجين، منخفضة للغاية لدرجة الحرارة التهجين، وسوء نوعية الحل تهجين، تلوث بارافورمالدهيد في غسل الصحون تسبب تحقيقات بشكل دائم إلى استجواب تصل إلى الأنسجة، مما يؤدي إلى تدهور riboprobe جزيئات صغيرة وصفها الأنسجة غير محدد، DTT الخاملة أو β-المركابتويثانول مما أدى عبر ربط S 35-RNA تحقيقات في ثنائي كبريتيد السندات إلى الأنسجة، والانتظار وقتا طويلا لأستلة. فمن الأهمية بمكان أن يكون الشرائح في حل أستلة في غضون ثوان من خلط انهيدريد الخل وترايثولامين. إذا تمر عدة دقائق معإضافة إلى حل لهذه الشرائح، وبعد ذلك ستقوم مجموعات الاسيتيل لا يمكن إزالتها بشكل فعال ومن ثم ربط الجيش الملكي النيبالي غير محدد. عوامل أخرى تشمل أكثر من 20 ساعة التهجين، والتي قد تولد قوية جدا من إشارة، وقطرات الزيت الزائد على الشرائح، والتي عزل حل التهجين على الشرائح أثناء غسيل مائي، مما أدى إلى البقع المشعة على الأنسجة والشرائح إشارات خلفية داكنة. إذا العمل مع الشرائح كثيرة (أكثر من 100 شريحة)، إضافة إلى 3 الثالثة كلوروفورم غسل أو تغيير يغسل كلوروفورم، لمنع فائض المعروض النفطي من جزيئات المتبقية على الشرائح. الإهمال علاج الأنسجة، أي ليست تجميد بسرعة كافية (في غضون 5-10 دقيقة بعد تشريح) أو الذوبان وإعادة تجميد يزيد أيضا خلفية بسبب تدهور مرنا. يجب الحرص على عدم الخلط خلفية للتعرض أكثر. لخلفية مستحلب على الشرائح انخفض من الممكن لأنها خفيفة جدا وحساس ويتطلب طويلة تعرض في الظلام. C مشاكل خلفية ommon تشمل أيضا ارتفاع في درجة الحرارة في المطور والمثبت. عندما تكون درجة الحرارة أعلى من 19 درجة مئوية، قريبة أو أكثر دفئا من درجة حرارة الغرفة، يتم الحصول على مزيد من الحبوب خلفية الفضة. وسوف تعرض لمستويات منخفضة من الضوء يتسرب إلى غرفة مظلمة تسبب خلفية مستحلب. عدم غسل خارج يتدخل لفترة كافية (على الأقل 30 دقيقة في الماء الجاري)، سوف تترك المثبت أن يتفاعل مع اللون البنفسجي ثم cresyl لإنشاء بنية اللون راسب في جميع أنحاء مستحلب. ومع ذلك، إذا تم غسلها الشرائح في الماء أطول من 90 دقيقة بعد تثبيت قبل تلطيخ البنفسجي cresyl، يمكن أن يسبب هذا مستحلب لتصبح فضفاضة والمقاطع إلى وصمة سيئة. إذا لم يكن هناك ما يكفي من الوقت لصبغ الشرائح ضمن إطار 30-90 دقيقة بعد التثبيت والغسيل، وبعد 30 دقيقة غسيل، تجفيف الشرائح بين عشية وضحاها، والمضي قدما مع البنفسجي cresyl تلطيخ في اليوم التالي. عموما، فإن معظم mRNAs محددة لديها أنماط التعبير الجيني، في حين أن إشارة الخلفية هو أكثر اتساقا. ove_content "> الأنسجة المطوية يمكن أن تكون مضللة من أجل تحقيق النتائج التعبير الجيني في فيلم الأشعة السينية، مما أدى إلى المنطقة مع إشارة أكثر قتامة. لتحديد ما إذا كان يتم طي النسيج، دراسة غير الملطخة أقسام تحت الساحة المظلمة أو أقسام البنفسجي cresyl الملون تحت brightfield. Cresyl counterstaining البنفسجي يوفر طريقة أفضل للنظر في حالة الأنسجة. للحصول على أفضل تفسير خصوصية التحقيق، ينبغي تطبيق تحقيقات بمعنى السيطرة على أجزاء مجاورة عدة. تحقيقات اكثر احساسا لا تظهر إشارة، ولكن القيام ببعض، وعندما تفعل ذلك، نجد أنه غالبا ما تكون مختلفة عن إشارة العقاقير. ونحن نعتقد أن هذا يمكن أن يعزى إلى تركيب العقاقير أو جين آخر على حبلا بواسطة العقاقير من الجينوم. نقدم مثالا Pax6 معنى وتحقيقات العقاقير (الشكل 2A وباء). حبلا بواسطة العقاقير يكشف عن وصفها على طول منطقة البطين من المخيخ، الدماغ الأمامي والعين كما هو متوقع (الشكل 2A)، ولكن يكشف عن إحساسوصفها في الطبقة الصبغية من الشبكية (الشكل 2B). لأحجام التحقيق، ونحن نستخدم تحقيقات [كدنا] في أي مكان في مجموعة من 300-5000 نقطة أساس. تحقيقات أقل من 300 نقطة أساس العمل، ولكن إشارات وعادة ما تكون أضعف. أننا لم نحاول تحقيقات أكبر من 5000 بت في الثانية. فمن الأفضل لاستخدام المجسات على أنسجة من نفس النوع إذا كان ذلك ممكنا. إن لم يكن، ونحن العابرة للهجن تحقيقات في أجزاء من الأنواع الأخرى والتقليل من التهجين، وأغسلها في درجات حرارة 3-5 درجة مئوية الزيادات على أساس الهوية تسلسل، إذا كان معروفا. إذا لم يعرف، ثم نقوم التجربة والخطأ التهجين وغسل درجات الحرارة. إذا تم خفض درجة الحرارة كثيرا، ويمكن لجنة التحقيق [كدنا] مع mRNAs غيرها من سلاسل مماثلة في أنحاء الأنواع أو في نفس النوع 11 عبر هجن. في الواقع، نجد أن cDNAs التي هي ~ 95٪ مطابقة أو أكبر من الهدف مرنا في الأنسجة، وتهجين الصارمة ودرجة الحرارة غسيل (65 درجة مئوية) الظروف يعمل بشكل جيد. لمتواليات التي هي في التهاب المفاصل الروماتويديقد nges من ~ 85 إلى 94٪ متطابقة، والتهجين ودرجة الحرارة غسيل يحتاج إلى تخفيض في حدود ~ 50 إلى 60 درجة مئوية سبب استخدام رف معدني في معظم الخطوات هو استخدام غسول الكلوروفورم والزايلين. على حد سواء العضوية تذوب العديد من أنواع البلاستيك. الزجاج وبعض أنواع البلاستيك المقاومة لهذه العضوية. لكن الزجاج أسهل للكسر، وبعض المواد البلاستيكية التي في البداية مقاومة سوف تذوب خلال فترات طويلة من التعرض للمواد العضوية. الشكل 1. تصوير الإشعاع الذاتي من الصور التهجين في الموقع من أفلام الأشعة السينية والشرائح مستحلب انخفض. (أ ب) الأشعة السينية الفيلم صورا لسهمي المقاطع رئيس الجامعة للمطربة فينش حمار وحشي في يوم الجنينية 10، تهجين مع riboprobes العقاقير إلى (A) أو FoxP1 CoupTF2 (B)، التي اتخذت مع إضاءة brightfield تحت المجهر تشريح. أسود، والحبوب التي تتعرض لها من فيلم يبين expre مرناssion. شريط مقياس = 500 ميكرون. (CD) انخفض مستحلب الصور الشريحة من سهمي المقاطع رئيس الجامعة للفينش حمار وحشي في يوم آخر يفقس 6، تهجين مع riboprobes العقاقير إلى (C) FoxP1 و (D). CoupTF2، التي اتخذت مع إضاءة الساحة المظلمة تحت المجهر تشريح أبيض، تتعرض حبيبات الفضة في مستحلب فوق الأنسجة يظهر التعبير مرنا. الأحمر والبنفسجي cresyl صمة عار. شريط مقياس = 200 ميكرون. لجميع صور، والمنقار منقاري إلى اليسار. وتعرض هذه الصور فيلم الأشعة السينية ليوم واحد، والشرائح انخفض لمدة 3 أيام. لجنة التحقيق هو 178 نقطة أساس FoxP1 إلى جزء من شركة بريتيش بتروليوم 1544-1711 مرنا؛ CoupTF2 هو 545 نقطة أساس إلى جانب بي بي 1-545 من مرنا. كما يمكن أن يرى، وضمن أثرى مرنا FoxP1 الدماغ المقدم في mesopallium (M)، المخطط (القديس)، والمهاد الظهري (DT)، في حين يتم تخصيب CoupTF2 في nidopallium (N)، arcopallium (A)، والمهاد أكثر بطني . هناك اتساق في التعبير بين أنواع التعرض (والأعمار). مع الشرائح انخفض، ومع ذلك، ينظر إلى وضع العلامات دقة أعلى،ويتم تحديد حدود مباشرة الأنسجة والتقسيمات الفرعية. وجميع هذه الصور الأخرى هو موضح في الورقة هي من المقاطع باستخدام معيار 65 درجة مئوية تهجين صرامة عالية. الشكل 2. مقارنة بين العقاقير ووضع العلامات بمعنى أنه يبين أنماط مختلفة. (A) وأعرب عن حبلا بواسطة العقاقير من Pax6 في الدماغ، وخصوصا في منطقة البطين (أبيض السهم). أظهرت هو تصوير الإشعاع الذاتي على أفلام الأشعة السينية من سهمي شرائح الرأس كله مأخوذ من فينش حمار وحشي في يوم الجنينية 12. (ب) قسم مجاور تهجين مع حبلا الشعور Pax6 يكشف عن أي خلفية التعبير في جميع أنحاء رأس الجنين، ولكن التعبير واضح في الطبقة الصبغية من الشبكية (الأسهم السوداء) كما حبلا بواسطة العقاقير. على خط متقطع يدل على كفاف من الدماغ كله. C: المخيخ. < قوي> الشكل 3. في إشارات الموقع في التعبير الجيني في الشرائح مستحلب انخفض المأخوذة من الدماغ فينش حمار وحشي أثناء المراحل الجنينية المتأخرة تحت وجهات النظر وbrightfield الساحة المظلمة. (A) Brightfield صورة التعبير D1B في يوم 10 من الجنينية التعرض العادي للمستحلب. ويمكن تسمية (أسود) بالكاد أن ينظر في هذا التكبير. التحقيق هو 625 نقطة أساس إلى جانب بي بي 1-625 من مرنا. (ب) تحول قسم متطابقة والتكبير كما هو الحال في (A) ولكن وجهة النظر الساحة المظلمة تظهر العلامة (أبيض) في المخطط (القديس)، والمهاد (TH). (C) Brightfield صورة Slit3 التعبير في 12 يوم الجنينية من التعرض لأكثر من مستحلب. ويمكن تسمية (أسود) بسهولة أن ينظر إليها. التحقيق هو 779 نقطة أساس إلى جانب 1243-2021 من مرنا. (ب) تحول قسم متطابقة والتكبير كما في (أ) إلى تسمية الساحة المظلمة رأي يظهر (أبيض) في النخاع الشوكي (SC) الذي يتطابق مع صورة brightfield. منقاري موجه الى اليسار. سي بي: المخيخ. ad/3764/3764fig4.jpg "ALT =" الشكل 4 "/> الشكل 4. فضة قرار الحبوب على المستوى الخلوي. أظهرت هو FoxP1 التسمية مرنا في الدماغ المقدم فينش حمار وحشي مع حبيبات الفضة (البقع السوداء) أعلاه الخلايا (اللون البنفسجي cresyl) في مناطق الدماغ المختلفة، والذين تتراوح أعمارهم مقارنة مع صور طاقة أقل من 1A الشكل و1C. (أ) التعبير عن وفرة عالية أكثر من الخلايا الفردية (الأسهم السوداء) في mesopallium الكبار فينش حمار وحشي. (ب) التعبير وفرة على ارتفاع منخفض فوق الخلايا الفردية (النصال أسود) في nidopallium المجاورة من نفس القسم. (ج) ارتفاع التعبير مرنا FoxP1 على الخلايا (الأسهم السوداء) في mesopallium الجنينية 12 يوم. (د) التعبير وفرة على ارتفاع منخفض فوق الخلايا (النصال أسود) في nidopallium المجاورة من نفس القسم. وحلقت الخلايا سبيل المثال مع خط أصفر. الخلايا الجنينية (C و D) هي أصغر حجما وأكثر إحكاما معبأة مقارنة مع الخلايا البالغة (A و B). وحيث أن هناك بعض المساحة بين الخلايا ومستحلب، منطقة معرضةحبيبات الفضة من تحقيق 35 S كبيرة قليلا من منطقة لهيئات الخلية. شريط النطاق = 10 ميكرون.

Discussion

ويستخدم على نطاق واسع المشعة في التهجين الموضعي التعبير مرنا لأغراض متعددة، بما في ذلك لدراسة منظمة إقليمية للنسيج، أنواع الخلايا، ونشاط المخ وظيفية ^{2-5،10،12-14.} لاستخدامها لاحقا على الجينات التي مرنا التعبير في الدماغ تعتمد على زيادة النشاط العصبي، وغالبا ما تسمى الجينات التي تعتمد على نشاط أو الجينات في وقت مبكر على الفور. مع هذه الاستخدامات، وقد تم تطبيق أسلوب لدينا عبر أنواع متعددة، بما في ذلك الطيور والثدييات (مثل الإنسان)، والأسماك، والبرمائيات، في أنسجة متعددة، بما في ذلك الدماغ والجلد والعضلات، والذين تتراوح أعمارهم متعددة، بما في ذلك السلاحف / حديثي الولادة، والأحداث والبالغين، وهنا في الفروع جنين كامل ^{2،3،5،15-17.} السمات الخاصة للبروتوكول لدينا ما يلي: (1) وتنتج توازنا بين خصوصية التشريحية والتحديد الكمي. لقياس التعبير الجيني في فيلم الأشعة السينية، ونحن نأخذ الصور الرقمية من الصور (مثلا:. الشكل 1A و 1B)، استخدم فوtoshop وظيفة الرسم البياني (أدوبي) لقياس كثافة بكسل في مناطق الاهتمام وطرح مستويات أساسية عن فيلم خارج من النسيج ولكن لا يزال على شريحة زجاجية ^2،4. لقياس التعبير على المستوى الخلوي، ونحن نأخذ صورا من الحبوب الفضة أكثر من الخلايا تحت التكبير عالية (40 100X؛ الشكل 4). نحن بعد ذلك استخدام عتبة ووظائف مقياس J صورة بواسطة Rasband وين في المعاهد الوطنية للصحة لحساب عدد من الحبوب الفضية في الصورة، وطرح عدد من خلفية في منطقة مماثلة من دون الخلايا على شريحة زجاجية، تقسيم من قبل عدد من الخلايا، للحصول على القيم والتعبير في كل خلية. ^4،18 (2) ويمكن أن يكون إنتاجية عالية نسبيا، مما يسمح للتجهيز 100-200 الشرائح في وقت واحد، ونظرا لضيق ختم ساترة التي أنشأتها المعدنية حمام الزيت. معيار طرق التهجين في الموضع يستغرق وقتا أطول لختم الشرائح مع parafilm، طلاء الأظافر، وغيرها من الوسائل، حيث الشرائح يستغرق الكثير من الفضاء، (3) وهي عاليةالحساسة من النصوص وفرة منخفضة نظرا لكبريتات ديكستران وحل دينهارت في المنطقة العازلة تهجين ^2،13، (4) ونهج التصوير في الساحة المظلمة يعطي صورا عالية على النقيض من ذلك بسبب التقاط الصور تحت إضاءة الساحة المظلمة على مجهر تشريح ^4،5. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح كشف حساسة للتغيرات الصغيرة في التعبير الجيني، مثل في التعبير الجيني التي تعتمد على نشاط لتحديد مناطق محددة في الدماغ تنشط أثناء الإدراك وإنتاج سلوكيات معينة ^19. القيود بالنسبة لغير المشعة البروتوكولات هي أن هذا الأخير أكثر وضوحا في القرار الخلوية وموقع مرنا داخل الخلية، والعمل مع مستحلب حساس جدا للتلاعب والضوء. ومن الممكن الجمع بين أسلوب لدينا مع وسائل أخرى، مثل مشعة غير تهجين موضعية لتسمية التعبير مرنا أكثر من جين واحد في نفس النسيج ^10،17،20. ويمكن دمجها مع كيمياء سيتولوجية مناعيةلتسمية كل من الحمض النووي الريبي والتعبير بروتين على نفس العينة من أجل المشاركة في توطين ومرنا مع بعض أنواع الخلايا ^10. وصفت التعديلات اللازمة لبروتوكول هذه التجارب وضع العلامات المزدوجة في المراجع المشار إليها.

وخلاصة القول، نهجنا يسهل فهم توقيت ومكان الخلوية في التعبير الجيني من أجل فهم تنظيم المنطقة، ونشاط الأنسجة وظيفية، وظيفة الجين.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Acetic anhydride	VWR	MK242002
Chloroform	VWR	BDH1109
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Cryostat	Thermo scientific	Microm HM550
Deionized formamide	Sigma	F9037
DTT	Promega	P1171	100mM
EDTA	Sigma	ED
Embedding mold	VWR	15160-215
Fisher brand Superfrost plus slide	Fisher Scientific	22-034-979
Formaldehyde	VWR	BDH0506-4LP
Formamide	Sigma	F7508
GENECLEAN kit	Q-Bio gene	1001-200
Kodak BioMax MR film	Sigma	Z350370
Kodak NTB Emulsion	Carestream Health	8895666
Kodak Professional developer D19	Kodak	1462593
Kodak professional Fixer	Kodak	1971746
β-mercaptoethanol	Calbiochem	444203
Mineral oil	VWR	IC15169491
NaOH	VWR	SX0600-1
Paraformaldehyde	Sigma	76240
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
rATP	Promega	P1132	10mM
rCTP	Promega	P1142	10mM
rGTP	Promega	P1152	10mM
RNasin	Promega	N2111	40Units/μl
S35 UTP	PerkinElmer	NEG039C001MC
Safety-Solve solution	Safety Solve Research Products International	111177
Sodium Acetate	Sigma	S7899	3M
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S3139
SP6 RNA polymerase	Promega	P1085
Staining metal rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
T7 RNA polymerase	Promega	P2075
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
5x Transcription buffer	Promega	P1181
Triethanolamine	VWR	IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	VWR	101449-446
tRNA	Roche	10109509001

Solutions:

1. Reagents for making of riboprobes: 1.5 μl DNA template (0.2-0.3 μg/μl), 2 μl of 5x optimized transcription buffer, 1 μl of 100mM DTT (comes with Polymerase from Promega, mix well at room temperature), 0.3 μl of RNasin (40 units/μl), 1.5 μl of AGC ribonucleotide mix solution, 3.5 μl of S³⁵ UTP, and 1 μl RNA polymerase. Bring up to 10 μl with nuclease-free water.
2. AGC ribonucleotide mix solution: mix equal amounts of 10mM ATP, GTP and CTP together.
3. Sodium acetate solution for EtOH precipitation to remove free S³⁵ UTP: 40 μl RNase and DNase free water, 5 μl of 3M Sodium Acetate, and 125 μl of 100% EtOH.
4. Hybridization buffer (10ml stock): 5 ml of 100% deionized formamide, 600 μl of 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8.0), 240 μl of 0.5M EDTA (pH =8.0), 100 μl of 100x Denhart’s solution, 100 μl of 1M DTT, 250 μl of 20mg/ml tRNA, 125 μl of 20 mg/ml poly A, and 1 g of Sodium Dextran Sulfate. Add DEPC-treated water to bring the total volume to 10 ml. Shake vigorously and then incubate at 55°C until all sodium dextran sulfate is dissolved. Store the hybridization buffer in -20°C, which is good for ~6 months.
5. 4% buffered paraformaldehyde solution: Add 40 g of paraformaldehyde in 760 ml distilled water in a flask designated for paraformaldehyde, heat to 50°C on a hot plate while stirring. Add 320 μl of 10N NaOH to help dissolve the paraformaldehyde. After dissolving (~10 min), add 100 ml of 10x PBS, and bring the volume up with distilled water until 1 liter. Stir and heat the solution until paraformaldehyde is dissolved. The pH should be 7.4.
6. Acetylation buffer: 13.6 ml of triethanolamine plus 2.52 ml of acetic anhydride in 1 liter of distilled water.
7. 20x SSPE solution: 3M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄-H₂O, and 200 mM EDTA in distilled water. Adjust solution to pH 7.4 with 10N NaOH.
8. 10x PBS buffer: 80g of NaCl, 2.0g of KCl, 14.4g of Na₂HPO₄, and 2.4g of KH₂PO₄ in distilled water. Adjust solution to pH 7.0 and bring total volume to 1 liter.
9. Second wash solution: 0.1% β-mercaptoethanol and 50% formamide in 2x SSPE
10. Cresyl violet acetate solution: 3% cresyl violet acetate in tap water (distilled water prevents good staining), dissolved overnight with stirring in a flask at room temperature. Filter with vacuum suction through a 1mm Whatman filter paper and Buchner funnel.