Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Радиоактивный На месте Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани

Published: April 27, 2012 doi: 10.3791/3764
Automatic Translation
1, 2, 1
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

Summary

Этот протокол успешно используется для количественного определения уровня и пространственные закономерности экспрессии мРНК в разных типах тканей через видов позвоночных животных. Этот метод может обнаружить низкий стенограммы изобилия и позволяет обрабатывать сотни слайдов одновременно. Мы представляем этот протокол, используя выражение профилирования птичьего эмбрионального формирование мозга в качестве примера.

Abstract

Знание сроков, уровня, сотовые локализации и типа клеток, что ген экспрессируется в способствует более глубокому пониманию функции гена. Каждая из этих функций может быть достигнуто с в гибридизация с мРНК в клетках. Здесь мы представляем на месте радиоактивного метода гибридизации изменение от Clayton и соавт. (1988) 1, который успешно работает в нашей лаборатории в течение многих лет, особенно для взрослых позвоночных мозг 2-5. Долго комплементарной РНК (кРНК) зондов для целевой последовательности позволяет для обнаружения низких стенограммы изобилие 6,7. Включение радиоактивных нуклеотидов в кРНК зондов позволяет дальнейшее чувствительность обнаружения низкого стенограммы изобилия и количественного анализа, либо светочувствительных рентгеновской пленки или эмульсии покрытие на ткани. Эти методы обнаружения обеспечивают долгосрочную целевую запись экспрессии генов. По сравнению с нерадиоактивных зонд методамиОРВ, таких как DIG-маркировки, радиоактивный метод гибридизации зонда не требует несколько этапов усиления использования HRP-антитела и / или TSA набор для обнаружения низких стенограммы изобилия. Таким образом, этот метод обеспечивает линейную зависимость между интенсивностью сигнала и количество целевых мРНК для количественного анализа. Это позволяет обрабатывать 100-200 слайдов одновременно. Он хорошо работает на разных стадиях развития эмбрионов. Большинство развития изучении экспрессии генов использовать все эмбрионы и нерадиоактивных подходы 8,9, отчасти потому, что эмбриональная ткань более хрупкая, чем у взрослых ткани, с меньшим количеством сцепление между клетками, что делает его трудно увидеть границу между клеточной популяции с срезах тканей. В отличие от наших радиоактивных подход, в связи с большим диапазоном чувствительности, может получить более высокую контрастность в резолюции экспрессии гена ткань между регионами, что делает его легче видеть границы между популяциями. Используя этот метод, исследователи смогли выявитьвозможные значения вновь выявленных генов, и в дальнейшем прогнозировать функции гена.

Protocol

1. Подготовка ткани

  1. Урожай свежих тканей. Для птичьего эмбриона, осторожно откройте яйца и очистить эмбрион в чашке с 1xPBS, в два раза. Для взрослого мозга, быстро удалить мозга и осторожно промыть 1 х PBS.
  2. Вставить эмбрионов или взрослого мозга в форме встроенного полный ОКТ ткани тек, ориентируясь ткани, сколько необходимо для секционирования и быстро заморозить блока, поместив его в этанол и сухую смесь льда, будьте осторожны, чтобы не получить смесь внутри блока .
  3. Нарежьте замороженных образцов в криостате в 10-12 мкм разделов. Для ткани головного мозга и эмбриональными, лучшие резки умеренно находится в пределах от -18 ° C до -20 ° C.
  4. Установите замороженных срезов на супер плюс стеклах.
  5. Хранить разделы в режиме слайд-поле при температуре -80 ° C.

2. Поколение радиоактивных Riboprobes (используйте радиационной безопасности процедур вашей организации)

  1. Создать очищенный линейный DNШаблон вашего кДНК интерес либо фермент ограниченной дайджест клонированного фрагмента окружении РНК-полимеразы промоутер сайтов с плазмидной ДНК методом ПЦР или вкладыша прикреплены к РНК-полимеразы промоутер сайтов связывания. Кроме того, можно создавать ПЦР фрагментов РНК-полимеразы промоутеров в рамках 3 'и 5' ПЦР праймера. Гели очистить ваш ограниченный или ПЦР фрагментов Geneclean комплект очистки гель.
  2. Для 0,5 мл трубки Эппендорфа, добавьте 0,5-1 мкг очищенного линейной матричной ДНК, транскрипция буфера, DTT, RNasin, AGC нуклеотидных решение смеси, и РНКазы свободной воды довести объем до необходимого количества. Затем добавьте S 35-UTP и соответствующие РНК-полимеразы, чтобы ни антисмысловых или чувство riboprobes.
  3. Выдержите смесь в течение 1 часа при 37 ° С на водяной бане. Добавьте еще аликвоту РНК-полимеразы и инкубировать в течение еще 1 часа.
  4. Добавить 3М ацетата натрия, раствор (0,1 раза от общего объема) и 100% этанола (2,5 лД. от общего объема) в трубку Eppendorf для осаждения синтезированы РНК riboprobe.
  5. Инкубируйте в сухой лед или -80 ° C в течение 15 минут или более чем на 3 часа, чтобы помочь осадков.
  6. Гранул РНК центрифугированием при 4 ° С и 15000 оборотов в минуту в настольной центрифуге Эппендорф в течение 30 мин.
  7. Удалить супернатант и промыть осадок 70% этанолом, коснитесь пальцами смешать гранулы хорошо.
  8. Гранул РНК снова центрифугированием при 4 ° С и 15000 оборотов в минуту в течение 30 мин.
  9. Удаляют супернатант полностью пипетировать, а затем добавить 40 мкл раствора гибридизации. Хорошо перемешать по пипетировать и выход.
  10. Положите 1 мкл раствора в 3 мл безопасностью Решите решение в сцинтилляционный флакон, хорошо перемешать и измерить импульсов в сцинтилляционных счетчиков.
  11. Поместите Эппендорф с riboprobe при температуре -20 ° C для использования в течение одной недели.

3. Ткань лечение

  1. В капот, подготовить свежий PBS буфером 4% paraformaldehyде-решение до 3-5 ° C выше комнатной температуры. Место слайды от -80 ° C хранение в металлической стойке на сухом льду, довести до рабочего пространства под капотом, а затем установите решетку на 4% параформальдегид решение, и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
  2. Промыть 3 раза в 1 х PBS около 15 провалов каждый (около 1 секунды за провал).
  3. В капот, чтобы ацетилирования буфера и энергично встряхните его в течение 10 секунд. Сразу вылить в лоток, стойки слайды и инкубировать в течение 10 мин, чтобы уменьшить фон связывания riboprobe.
  4. Промыть 3 раза в 2 х ГНПП для 15 повторений.
  5. Высушить в 70%, 95% и 100% этанола последовательный в течение 2 минут на каждом этапе (не должно быть в капюшоне).
  6. Высушите слайдов под капотом, по крайней мере 10-15 минут.

4. Гибридизация

  1. Рассчитать количество riboprobe (0,5 1x10 6 копий в минуту в слайд) и гибридизации решения (100 мкл на слайд), необходимых для всех слайдов. Prewaгт riboprobe-гибридизации смеси до 65 ° C в течение 5 минут для денатурации riboprobe.
  2. Внесите 100 мкл riboprobe-гибридизация решение в линейке по слайду, а также использовать стекло покровное, чтобы равномерно распределяют его по ткани и покровное. Место скользит горизонтально, вертикально стоящих в стойку металл и место стойке медленно вертикально на 65 ° C масляной ванне в течение минимум 4 часов и до 16 часов. Масло создает герметичное уплотнение по всему покровные.
  3. Удалите металлические стеллажи с масляной ванне и протрите излишки жира вокруг стойки с папиросной бумагой.
  4. Смыть масло с закрытой горки и металл стойки в стеклянных или металлических лотков, содержащих хлороформ, в два раза. 2-й хлороформ мытья можно использовать в качестве первой для следующего эксперимента.
  5. Трансфер в стойку с закрытыми вставляется лоток на 0,1% β-меркаптоэтанол + 2 х ГНПП решение и двигаться вверх и вниз в течение нескольких провалов, чтобы ослабить покровные и удалить избыток растворить гибридизации решенияТион.
  6. Трансфер в стойку с закрытыми слайдов в свежий раствор 0,1% β-меркаптоэтанол + 2 х ГНПП, а затем удалите покровные с РНКазы бесплатно пинцетом в растворе для предотвращения царапин срезах тканей. Передача непокрытой слайды в свежем стойке в лоток горизонтальный держатель стойки слайд, в растворе 0,1% β-меркаптоэтанол в 2 х ГНПП.
  7. Инкубируйте стойку с горки на свежем 0,1% β-меркаптоэтанол + 2 х ГНПП раствора при комнатной температуре в течение 1 часа, чтобы удалить избыток несвязанных РНК зонд. Сбросьте эту и предыдущую водных растворов стирки, а также покровные, как радиоактивные отходы.
  8. Трансфер в стойку с горки на подогретую 2x ГНПП решение при 65 ° С, добавить β-меркаптоэтанол к окончательному 0,1% концентрации, и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 1 часа. Выбросить в качестве радиоактивных отходов.
  9. Передача и инкубировать в стойку с горки два раза в подогретую 0,1 х SPPE при 65 ° С в течение 30 минут каждый. Количество радиоактивного удаленыэтот шаг очень мало и больше не считается чрезмерным радиоактивные отходы после этого шага.
  10. Высушить стойки и горки в 70%, 95% и 100% этанола в течение 2 минут каждый.
  11. Высушите слайды в капюшоне, по крайней мере 30 мин.

5. Визуализация радиоактивных сигналов

  1. Поместите сухой скользит в кассету и в темной комнате, поместите рентгеновской пленки (Kodak BioMax MR фильм) на слайдах, и закройте кассету. Убедитесь, что слайды с которыми сталкиваются стороны эмульсии рентгеновской пленки. Вынести слайды ~ 1-7 дней в зависимости от ожидаемого изобилия стенограммы.
  2. Развитие рентгеновской пленки в стандартных разработчик и фиксаж. Гибридизации сигнала отображается как черный (серебро подвергается зерен в эмульсии) на пленке (рис. 1).
    1. (Необязательно) Чтобы определить клеточный разрешение и увидеть сигнал на ткани, слайды должны быть, смоченной в фотоэмульсии и контрастно.Если вы собираетесь в конечном счете, контрастирующая окраска с крезиловый фиолетовый, то delipidize разделов путем инкубации в ксилоле в течение 5 мин при комнатной температуре в два раза, увлажняет 1 мин каждая на 100%, 100%, 95%, 95%, 70% и 50% этанола , а затем в дистиллированной воде. Если вы не собираетесь пятно с красителем, который не требует delipidization, то delipidization не является необходимым. Сухой слайды и под капотом, по крайней мере 2-3 часов.
    2. В темной комнате, на основе безопасных свет, выкопайте достаточно Kodak НТБ эмульсии, чтобы покрыть половину слайд продольные (т.е. ткани) в стеклянном контейнере погружения, а затем растопить в 42 ° С на водяной бане 20-30 мин. Затем разбавить его дистиллированной водой до 1:1. Уровень эмульсии должно охватывать все разделы на слайде, когда слайд погружается в нее. Если у вас есть много слайдов, может потребоваться дополнительная подготовка эмульсии.
  4. Dip слайды в разбавленной эмульсии в 42 ° С на водяной бане и сухой ближнего слайды в закрытом светонепроницаемый контейнер overnigНТ в темной комнате, или в духовке при температуре 37 ° С в течение 2-3 часов, с выключенным светом.
  5. Передача слайдов в стойках слотов в черных коробках, содержащих сушильные шкафы, будьте осторожны на слайдах не соприкасаются друг с другом и тем самым создать артефакты. Печать краям коробки с черной изоленты медленно, чтобы предотвратить статический вызванных искрами света, а затем обернуть коробки в алюминиевую фольгу. Храните коробки на 4 ° С от нескольких дней до нескольких недель (сигнал от 1 дня на рентгеновской пленке похож на 5 дней в эмульсию).
  6. Теплый слайд коробки до комнатной температуры в течение 1 часа.
  7. В темной комнате, снимите стойку с горками (или местом, слайды в металлической стойке при использовании коробки со слайд-слота) из коробки и развивать их в Kodak D-19, разработчик при 16 ° С в течение 3,5 мин.
  8. Вымойте разработаны слайды в водопроводной воде при комнатной температуре в течение 1 мин.
  9. Инкубируйте слайды дважды в фиксаж на 19 ° С в течение 6 минут каждый. Свет может быть включен во второй инкубации фиксаж. Вымойте слайды в проточной воде при комнатной температуре в течение 30 мин и очистить эмульсией с обратной стороны слайд-при "мокрых" бритвой, чтобы не поцарапать стекло.
  10. Пятно ткани с 0,3% крезиловый фиолетовый в водопроводной воде в течение 5 мин.
  11. Вымойте дополнительные крезиловый решение фиолетовый в пресной водой из-под крана в течение ~ 15 повторений.
  12. Высушить слайды ~ 15 повторений в каждом спиртовом растворе: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% и 100% этанола.
  13. Инкубируйте слайды в ксилоле в течение 5 мин при комнатной температуре в два раза.
  14. Покровные стекла с Permount среды на слайд и высушите покрытый слайдов в капюшоне на ночь (> 16 часов), это займет несколько дней до клея достаточно крепкими, чтобы очистить слайды дальше.

6. Создание изображения Darkfield цвета

  1. При необходимости дальнейшего чистый избыток эмульсии на фоне слайдов (не coversliped стороне без ткани) на смачивание ее водой и очищая с лезвием бритвы.
    2. <LI> промыть стекла с 80% этанола и решение уничтожить 1-2 раз осторожно, чтобы избавиться от мусора и пыли.
  2. Фотосъемка в темном поле или светлом освещении. Шаги 6.2 и 6.3, возможно, придется повторить 2-3 раза, чтобы получить хорошее изображение без частицы пыли, которые хорошо видны на темном поле при вскрытии микроскопом.

7. Представитель Результаты

Два основных способа просмотра на месте результаты гибридизации на срезах тканей гибридизации с S 35 радиоактивных зондов: 1) рентгеновской пленки, которая была помещена на слайды или 2) эмульсия, которая была покрыта на слайдах. Третий подход использует phosphorimager экран, расположенный на слайдах, но мы не были удовлетворены решением этого подхода. Рентгеновской пленки обеспечивают быстрый результат и анализ общего состояния гибридизации. Рентгеновской пленке данные также показывает широкую анатомическую разрешение и может быть использована для количественного analys10. Примеры рентгеновской пленке изображение конце главы птичьего эмбриона гибридизации с антисмысловые зонды для FoxP1 и CoupTF2 экспрессии генов в цифрах 1A и B. Оба гена весьма распространены в конкретных подразделениях головного мозга. Хорошего качества рентгеновской пленки результат должен быть острым (не размытыми) и имеют высокое отношение сигнал к фону. Размытое изображение может быть связано с неравномерным контакт между рентгеновской пленке и стекле с гибридизированных ткани.

Для эмульсии ближнего слайды, эмульсия содержит светочувствительные соли серебра наносят на ткань, соединенный того, что на пластик рентгеновской пленки. Во время разработки, S 35, подвергшихся воздействию солей серебра превращаются в металлическое серебро зерна, как и в рентгеновской пленке. Тем не менее, месторождение серебра из них видно непосредственно на клетки представляют экспрессии генов, которые можно наблюдать и измерять качественно под микроскопом. Металлических зерен серебра блокировать прямой свет черези выглядят как черные точки зрения в светлое. Крезиловый контрастирующая окраска появляется фиолетовый фиолетовый цвет (рис. 3А, 3С, а на рис. 4). В темном поле, серебро зерна отражать свет, исходящий со стороны и появляются в виде белых точек (рис. 1C, 1D, 3B и 3D). В этой ситуации, фиолетовые пятна крезиловый появляется красный цвет. В светлом, гибридизация сигнал легче просматривать при большом увеличении на клеточном резолюцию, в то время как в темном поле, кроме того, гибридизация сигнал можно рассматривать под более низкий увеличение по всей ткани. Вид темного поля является подход, мы обычно используем, чтобы показать общую картину экспрессии генов. Тем не менее, по сравнению с быстрым результатом, полученным с рентгеновских снимков, слайдов эмульсии ближнего занимает больше времени (от одного до нескольких недель) и более чувствительна к получению фоне.

Есть четыре основных источников сильного фона: 1) История всей рентгеновской пленки, как правило, сделать, чтобыпроблемы с застройщиком или закрепитель или частично отснятой пленкой, 2) Справочная информация о стеклах, как правило, из-за проблем со стиральной или стекло подготовки, такие как неправильное silination из слайдов из коммерческих источников или самостоятельно подготовленные, 3) Эмульсия воздействия и предпосылки развития и 4) Справочная информация по разделу связано либо с отсутствием тщательного после гибридизации шаги стирки, слишком низкую температуру гибридизации, низкое качество гибридизации решение, параформальдегид загрязнения мыть посуду вызывает датчиков постоянно перекрестные ссылки на ткани, riboprobe, ведущих к деградации малых молекул маркировке ткани неспецифически, неактивные DTT или β-меркаптоэтанол в результате сшивки из S 35-РНК-зонды в ди-сульфидных связей в ткани, и ждать слишком долго для ацетилирования. Очень важно, чтобы слайды в ацетилирования решение в течение нескольких секунд смешивания ангидрида уксусной кислоты и триэтаноламин. Если несколько минут пройти withouт добавив решение слайды, а затем ацетил группы, не будут эффективно удалены, а затем связываются с РНК, не специально. Другие факторы включают гибридизация в течение 20 часов, которые могут генерировать слишком сильным сигналом, а избыток капель масла на слайды, которые поглощают гибридизации решение на слайдах во время моющие растворы, в результате радиоактивного пятна на ткани и слайды дает темный фон сигналов. Если вы работаете с большим количеством слайдов (более 100 срезов), добавить 3 хлороформа мыть или изменить хлороформ моет, для предотвращения чрезмерного частиц масла из оставшихся на слайдах. Неосторожное обращение ткани, то есть не замораживание достаточно быстро (в течение 5-10 мин после вскрытия) или размораживания и повторного замораживания и увеличивает фон, связанный с мРНК деградации. Будьте внимательны и не перепутайте фон для передержки.

Для эмульсии на фоне ближнего слайды можно, потому что это очень светочувствительными и требует длительной экспозиции в темноте. Com проблемы пн фоне включают слишком высокой температуры для разработчиков и фиксаж. При температуре выше 19 ° C, близко или теплее комнатной температуры, более серебряном фоне зерна получается. Воздействие низких уровнях света просачивается в темной комнате может привести эмульсии фоне. Не вымывания фиксаж достаточно долго (по крайней мере 30 минут в проточной воде), оставят фиксаж, что тогда вступает в реакцию с крезиловый фиолетовый для создания коричневатый осадок всей эмульсии. Однако, если слайды промывают в воде дольше, чем 90 минут после фиксации перед окрашиванием крезиловый фиолетовый, это может привести к эмульсии, чтобы стать свободным и разделы пятно плохо. Если нет достаточно времени, чтобы пятно слайдов в пределах 30-90 мин после фиксации окна и стирки, после 30 минут мыть, сушить слайды в ночное время и продолжить крезиловый фиолетового окрашивания на следующий день. Как правило, большинство мРНК имеют специфические закономерности экспрессии генов, в то время как фоновый сигнал более равномерным.

e_content "> сложенном ткань может ввести в заблуждение результатов экспрессии генов на рентгеновской пленке, ведущих в область с более темными сигнала. Чтобы определить, является ли ткань сложить, исследовать, не окрашенные срезы в темном поле или крезиловый фиолетовый окрашенные срезы под светлое. крезиловый фиолетовый counterstaining обеспечивает лучший способ для изучения тканей состоянии.

Для лучшей интерпретации зонд специфику, датчики контроля смысл должен быть применен на нескольких соседних участках. Большинство датчиков смысле не показывают сигнал, но некоторые делают, и когда они это сделают, мы находим, что часто отличается от антисмысловых сигнала. Мы считаем, что это может быть связано с антисмысловые синтеза или иного гена на антисмысловой нити генома. Приведем пример Pax6 смысл и антисмысловых зондов (рис. 2, Б). Антисмысловых нитей показывает, маркировка по желудочка зоне переднего мозга, мозжечка и глаз, как ожидалось (рис. 2), но смысл показывает, лаbeling в пигментный слой сетчатки (рис. 2В).

Для зонда размеров, мы используем кДНК зонды в любой точке диапазона 300-5000 бит в секунду. Зонды менее 300 бит работы, но сигналы, как правило, слабее. Мы не пытались зондов больше, чем 5000 бод. Лучше всего использовать датчики на ткани того же вида, если это возможно. Если нет, мы пересекаем-гибридизации зонды на участках других видов и уменьшение гибридизации и мыть температура 3-5 ° С шагом на основе идентичности последовательности, если они известны. Если не известно, то мы выполняем методом проб и ошибок гибридизации и мыть температурах. Если температура опускается слишком много, кДНК зонд может перекрестно скрещиваться с другими мРНК подобной последовательности разных видов или у тех же видов 11. На практике мы обнаружили, что кДНК, которые составляют ~ 95% или более идентичных по цели в мРНК ткани, строгие гибридизации и температуру стирки (65 ° C) условиях работает хорошо. Для последовательностей, которые находятся в рангех годов ~ 85 до 94% идентичны, гибридизации и температуру стирки, возможно, должны быть сокращены в диапазоне от ~ 50 до 60 ° C.

Причина для использования металла стойки в большинстве шагов использования хлороформа моет и ксилол. И органические расплава многих видов пластмасс. Стекло и некоторых видов пластмасс, устойчивых к этим органики. Но стекло легче сломать, и некоторые виды пластика, что на первый устойчивы будет таять в течение длительных периодов воздействия органических веществ.

Рисунок 1
Рисунок 1. Авторадиографии в гибридизация изображения с рентгеновской пленки и эмульсии ближнего слайдов. (AB) рентгеновской пленке изображение сагиттальной целые разделы главы зебры зяблик певчих птиц в эмбриональном 10-й день, гибридизации с антисмысловой riboprobes в (A) FoxP1 или (B) CoupTF2, взятые с подсветкой светлого под микроскопом рассечения. Черный, подвергаются зерна в фильм, показывающий мРНК экспрессионов. Шкала бар = 500 мкм. (CD) Эмульсия смоченной слайд изображение сагиттальной целые разделы главы зебры зяблик на пост люк 6-й день, гибридизации с антисмысловой riboprobes (С) ​​FoxP1 и (D) CoupTF2, взятых с освещением темного поля при вскрытии микроскопом. Белый, серебро подвергается зерен в эмульсии выше ткани показывает экспрессию мРНК. Красный, фиолетовый крезиловый пятно. Шкала бар = 200 мкм. За все картины, клюв ростральной влево. Рентгеновские снимки фильм подвергались в течение одного дня, ближнего слайды в течение 3 дней. Зонд FoxP1 составляет 178 б.п. до 1544-1711 б.п. части мРНК; CoupTF2 составляет 545 б.п. до 1-545 б.п. части мРНК. Как видно, в мРНК переднего мозга FoxP1 обогащается mesopallium (M), стриатуме (St) и спинной таламус (DT), в то время как CoupTF2 обогащается nidopallium (N), arcopallium (А), и более вентральный таламус . Существует последовательность в выражении между воздействием типов (и возраста). С ближнего слайды, однако, более высокое разрешение маркировки видно,г ткани границы и подразделений, непосредственно определены. Эти и другие изображения, показанный в статье взяты из разделов используя стандартный 65 ° C высокая жесткость гибридизации.

Рисунок 2
Рисунок 2. Сравнение антисмысловых и чувство маркировка, которая показывает различные узоры. (A) антисмысловой нити Pax6 было выражено в головном мозге, особенно желудочковой зоны (белая стрелка). Показана авторадиографии на рентгеновских пленках сагиттального все кусочки глава взята из зебры зяблик в эмбриональном день 12. (B) смежные секции гибридизации с чувством прядь Pax6 не обнаруживает фон выражение всей эмбриона головой, но очевидно выражение в пигментный слой сетчатки (черные стрелки), антисмысловой нити. Пунктирная линия показывает контур весь мозг. C: мозжечка.

Рисунок 3
Ронг> Рисунок 3. В месте сигналов экспрессии генов в эмульсии ближнего слайдов, взятых из мозга зебры зяблик на поздних эмбриональных стадий в светлом и темном поле просмотра. (A) светлое изображение D1B выражение в эмбриональном 10-й день от обычного воздействия на эмульсию. Этикетке (черный) едва ли можно увидеть на этом увеличении. Зонд составляет 625 б.п. до 1-625 б.п. части мРНК. (Б) одинаковые секции и увеличение, как в (), но перешел на мнение темнопольные показывает метки (белый) в стриатуме (St) и таламуса (TH). (C) светлое изображение Slit3 выражение в эмбриональном 12 день от воздействия на эмульсию. Label (черный) легко видеть. Зонд является 779 б.п. до 1243-2021 части мРНК. (Б) одинаковые секции и увеличение, как в (A) перешли на темном поле зрения показывает метки (белый) в спинном мозге (SC), который соответствует светлое изображение. Ростральные ориентировано влево. Cb: мозжечка.

/ 3764/3764fig4.jpg "ALT =" Рисунок 4 "/>
Рисунок 4. Серебряная зерна разрешение на клеточном уровне. Показана FoxP1 мРНК метки в зебру зяблик переднего мозга с зернами серебра (черные точки) выше клеток (крезиловый фиолетовый) в различных регионах мозга и возраста по сравнению с более низкой мощностью изображения рис. 1А и 1С. (А) Высокая выражение изобилия над отдельными ячейками (черные стрелки) у взрослых зебр зяблик mesopallium. (В) Низкая выражение изобилия над отдельными ячейками (черные стрелки) в соседних nidopallium того же раздела. (C) Высокая FoxP1 экспрессию мРНК на клетки (черные стрелки) в 12-й день эмбрионального mesopallium. (D) Низкий выражение изобилия на клетки (черные стрелки) в соседних nidopallium того же раздела. Пример клетки круг с желтой линией. Эмбриональные клетки (C и D) меньше по размеру и более плотно упакованы по сравнению с взрослыми клетками (А и Б). Так как есть некоторое пространство между клетками и эмульсии, площадь открытых сиlver зерна от S 35 зонд немного большим, чем площадь клеточных тел. Шкала бар = 10 мкм.

Discussion

Радиоактивные в гибридизация мРНК выражение широко используется для различных целей, в том числе для изучения региональной организации ткани, типах клеток и мозга функциональной активности 2-5,10,12-14. Последующего использования на гены, экспрессия мРНК в мозге зависит от повышенной нервной деятельности, которую часто называют деятельность зависит от генов или немедленного ранних генов. С учетом этих целей, наш метод был применен на несколько видов, в том числе птиц, млекопитающих (например, человека), рыб и земноводных, во многих тканях, включая мозг, кожу и мышцы, и несколько веков, в том числе птенцов / новорожденных, подростков , взрослые, а вот в целые разделы эмбриона 2,3,5,15-17. Особенность нашего протокола, включают: (1) дает баланс между анатомическим специфику и количественные специфику. Для количественной оценки экспрессии генов на рентгеновской пленке, мы принимаем цифровые фотографии изображений (например: Рис. 1А и 1В), используйте Photoshop (Adobe) функция гистограммы для измерения плотности пикселей в регионах, представляющих интерес и вычитание фона на пленке вне ткани, но по-прежнему на стекле 2,4. Для количественного выражения на клеточном уровне, мы принимаем изображения зерен серебра на клетки при большом увеличении (40-100X; рис. 4). Затем мы используем порог и меру функции изображения J Уэйн Rasband в NIH для подсчета количества зерен серебра в образ, вычесть из счета фона в аналогичной области без клеток на стекле, разделите на количество клеток, чтобы получить значение выражения в клетке. 4,18 (2) может быть относительно высокой пропускной способностью, что позволяет обработку 100-200 слайдов одновременно, из-за уплотнения покровное созданы ванны минеральные масла. Стандартный на месте методы гибридизации занимает больше времени, чтобы запечатать слайды с парафильмом, лак для ногтей и других средств, где слайды занимают много места (3) Вполнечувствительна к низким стенограммы из-за обилия декстран сульфата и решение Денхардта в гибридизации буфер 2,13; (4) изображение подход в темном поле дает изображения с высоким контрастом благодаря съемке с освещением темного поля на вскрытии 4,5 микроскопом. Кроме того, это позволяет чувствительны обнаружения небольших изменений в экспрессии генов, таких, как зависимого от активности экспрессии генов для выявления конкретных областей мозга активируется при восприятии и производстве конкретного поведения 19. Ограничения относительно нерадиоактивных протоколов, что последние являются более ясной в клеточном разрешение и расположение мРНК в клетке, и работа с эмульсией очень чувствительны к манипуляциям и света. Можно объединить наш метод с другими методами, такими как нерадиоактивных в гибридизация маркировать экспрессию мРНК более чем одного гена в той же ткани 10,17,20. Это может быть объединена с иммуноцитохимиипометить как РНК и белка выражение того же образца, с тем чтобы совместно локализации мРНК с определенными типами клеток 10. Протокол изменения, необходимые для такой двойной маркировки эксперименты описаны в цитированной литературы.

Таким образом, наш подход облегчает понимание о сроках и месте сотовый экспрессии генов для того, чтобы понимание региона организацию, функциональную активность тканей и функции гена.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить всех Джарвис лаборатории членов, которые улучшили протокол на протяжении многих лет.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride VWR MK242002
Chloroform VWR BDH1109
Cresyl violet acetate Sigma C5042
Cryostat Thermo scientific Microm HM550
Deionized formamide Sigma F9037
DTT Promega P1171 100mM
EDTA Sigma ED
Embedding mold VWR 15160-215
Fisher brand Superfrost plus slide Fisher Scientific 22-034-979
Formaldehyde VWR BDH0506-4LP
Formamide Sigma F7508
GENECLEAN kit Q-Bio gene 1001-200
Kodak BioMax MR film Sigma Z350370
Kodak NTB Emulsion Carestream Health 8895666
Kodak Professional developer D19 Kodak 1462593
Kodak professional Fixer Kodak 1971746
β-mercapt–thanol Calbiochem 444203
Mineral oil VWR IC15169491
NaOH VWR SX0600-1
Paraformaldehyde Sigma 76240
Poly A Invitrogen POLYA.GF
rATP Promega P1132 10mM
rCTP Promega P1142 10mM
rGTP Promega P1152 10mM
RNasin Promega N2111 40Units/μl
S35 UTP PerkinElmer NEG039C001MC
Safety-Solve solution Safety Solve Research Products International 111177
Sodium Acetate Sigma S7899 3M
Sodium phosphate dibasic Sigma S3264
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
SP6 RNA polymerase Promega P1085
Staining metal rack Electron Microscopy Sciences 70312-54
T7 RNA polymerase Promega P2075
Tissue-Tek OCT Sakura 4583
5x Transcription buffer Promega P1181
Triethanolamine VWR IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) VWR 101449-446
tRNA Roche 10109509001

Solutions:
  1. Reagents for making of riboprobes: 1.5 μl DNA template (0.2-0.3 μg/μl), 2 μl of 5x optimized transcription buffer, 1 μl of 100mM DTT (comes with Polymerase from Promega, mix well at room temperature), 0.3 μl of RNasin (40 units/μl), 1.5 μl of AGC ribonucleotide mix solution, 3.5 μl of S35 UTP, and 1 μl RNA polymerase. Bring up to 10 μl with nuclease-free water.
  2. AGC ribonucleotide mix solution: mix equal amounts of 10mM ATP, GTP and CTP together.
  3. Sodium acetate solution for EtOH precipitation to remove free S35 UTP: 40 μl RNase and DNase free water, 5 μl of 3M Sodium Acetate, and 125 μl of 100% EtOH.
  4. Hybridization buffer (10ml stock): 5 ml of 100% deionized formamide, 600 μl of 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8.0), 240 μl of 0.5M EDTA (pH =8.0), 100 μl of 100x Denhart's solution, 100 μl of 1M DTT, 250 μl of 20mg/ml tRNA, 125 μl of 20 mg/ml poly A, and 1 g of Sodium Dextran Sulfate. Add DEPC-treated water to bring the total volume to 10 ml. Shake vigorously and then incubate at 55 °C until all sodium dextran sulfate is dissolved. Store the hybridization buffer in -20 °C, which is good for ~6 months.
  5. 4% buffered paraformaldehyde solution: Add 40 g of paraformaldehyde in 760 ml distilled water in a flask designated for paraformaldehyde, heat to 50 °C on a hot plate while stirring. Add 320 μl of 10N NaOH to help dissolve the paraformaldehyde. After dissolving (~10 min), add 100 ml of 10x PBS, and bring the volume up with distilled water until 1 liter. Stir and heat the solution until paraformaldehyde is dissolved. The pH should be 7.4.
  6. Acetylation buffer: 13.6 ml of triethanolamine plus 2.52 ml of acetic anhydride in 1 liter of distilled water.
  7. 20x SSPE solution: 3M NaCl, 200 mM NaH2PO4-H2O, and 200 mM EDTA in distilled water. Adjust solution to pH 7.4 with 10N NaOH.
  8. 10x PBS buffer: 80g of NaCl, 2.0g of KCl, 14.4g of Na2HPO4, and 2.4g of KH2PO4 in distilled water. Adjust solution to pH 7.0 and bring total volume to 1 liter.
  9. Second wash solution: 0.1% β-mercapt–thanol and 50% formamide in 2x SSPE
  10. Cresyl violet acetate solution: 3% cresyl violet acetate in tap water (distilled water prevents good staining), dissolved overnight with stirring in a flask at room temperature. Filter with vacuum suction through a 1mm Whatman filter paper and Buchner funnel.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
  2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
  3. Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  4. Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
  5. Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
  6. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
  7. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  8. Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
  9. Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
  10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
  11. Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
  12. Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
  13. Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
  14. Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  15. Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
  16. Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363 (2005).
  17. Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
  18. Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
  19. Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768 (2008).
  20. Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).

Tags

Neuroscience выпуск 62, радиоактивных riboprobes позвоночных эмбрион серебра эмульсии темного поля генетика
Радиоактивный<em> На месте</em> Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. … More

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. J. Vis. Exp. (62), e3764, doi:10.3791/3764 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter