Radioaktivt In situ Hybridisering til påvisning af Forskellige genekspressionsmønstre i Tissue

Summary

Denne protokol er med held anvendt til kvantitativ detektering niveauer og rumlige mønstre af mRNA-ekspression i forskellige vævstyper tværs vertebrate arter. Fremgangsmåden kan detektere lave tæthed transkripter og tillader behandling af hundredvis af objektglas samtidigt. Vi præsenterer denne protokol ved hjælp af udtryk profilering af aviær embryonale hjernens dannelse som et eksempel.

Abstract

Kende timing, plan cellulær lokalisering og celletype, et gen udtrykkes i bidrager til forståelsen af ​​funktionen af ​​genet. Hver af disse funktioner kan opnås med in situ-hybridisering til mRNA i celler. Her præsenterer vi et radioaktivt in situ hybridisering metode modificeret fra Clayton et al. (1988) ^1, der har arbejdet med succes i vores laboratorium i mange år, især for voksne hvirveldyr hjerner ^2-5. De lange komplementære RNA (cRNA) prober til målsekvensen tillader detektion af lave forekomst transkripter ^6,7. Inkorporering af radioaktive nucleotider i de cRNA-prober tillader yderligere påvisning følsomhed lav hyppighed transkripter og kvantitative analyser, enten ved lysfølsomme røntgenfilm eller emulsion coatet over vævet. Disse påvisningsmetoder tilvejebringe en langsigtet registrering af målgenekspression. Sammenlignet med ikke-radioaktiv probe methODS, såsom DIG-mærkning, er den radioaktive probehybridisering metode ikke kræver multiple amplifikationstrin under anvendelse af HRP-antistoffer og / eller TSA kit til påvisning af lave forekomst transkripter. Derfor er denne fremgangsmåde tilvejebringer et lineært forhold mellem signalintensitet og målrettet mRNA mængder til kvantitativ analyse. Det tillader behandling 100-200 objektglas samtidigt. Det fungerer godt for de forskellige udviklingsstadier i embryoner. Mest udviklingsmæssige undersøgelser af genekspression anvender hele embryoner og ikke-radioaktive fremgangsmåder ^8,9, til dels fordi embryonisk væv er mere skrøbelige end voksent væv, med mindre sammenhængen mellem cellerne, hvilket gør det vanskeligt at se grænser mellem cellepopulationer med vævssnit. I modsætning hertil er vores radioaktiv fremgangsmåde på grund af den større udvalg af følsomhed, der kan opnå højere kontrast i opløsning af genekspression mellem vævsområder, hvilket gør det lettere at se grænser mellem populationer. Anvendelse af denne fremgangsmåde, kan forskerne afslørermulige betydning af en nyligt identificerede gen, og yderligere forudsige funktionen af ​​genet af interesse.

Protocol

1. Vævspræparat Høste friske væv. For aviær embryoner, åbner forsigtigt æg og rengør embryo i et fad med 1XPBS, to gange. For voksne hjerner fjernes hurtigt hjernen og forsigtigt vaskes med 1 x PBS. Integrer embryoner eller voksne hjerne i en integreret form fuld af oktober væv Tek, orientere vævet som er nødvendig for sektionering, og hurtigt fryse blokken ved at placere det i en ethanol og tøris blandingen, være omhyggelig med ikke at få blandingen indersiden af ​​blokken . Skær frosne prøve i en kryostat i 10-12 um tykke snit. I hjernen og embryonisk væv, er den bedste skærende tempereret i området -18 ° C til -20 ° C. Monter frosne afsnittene om super plus glas dias. Opbevar sektioner i et dias boks ved -80 ° C. 2. Generering af radioaktive riboprober (Brug stråling sikkerhedsprocedurer i din institution) Generer en renset lineære DNEn skabelon for din cDNA af interesse, enten ved enzym begrænset fordøjelse af et klonet fragment omgivet af RNA-polymerase-promoter-områder fra plasmid-DNA eller ved PCR af indsatsen fastgjort til RNA-polymerase-promoter bindingssteder. Det er også muligt at frembringe PCR-fragmenter med de RNA-polymerasepromotorer som en del af 3'-og 5'-PCR-primere. Geler lutrer begrænsede eller PCR-genererede fragmenter med GeneClean geloprensning kit. Til en 0,5 ml Eppendorf-rør, 0,5-1 ug af oprenset lineært DNA-skabelon, transkription puffer, DTT, RNasin, AGC nukleotid-blanding opløsningen, og RNase frit vand tilsættes for at bringe volumenet op på den ønskede mængde. Derefter tilsættes S 35-UTP og den passende RNA-polymerase for at gøre enten antisense-eller sense riboprober. Inkubere blandingen i 1 time i et 37 ° C vandbad. Tilsættes en anden portion af RNA-polymerase og inkuberes i yderligere 1 time. Tilsættes 3M natriumacetat-opløsning (0,1 fold af det samlede volumen) og 100% EtOH (2,5 fold af totalt volumen) i Eppendorf rør for at præcipitere syntetiseret RNA riboprobe. Inkuber i tøris eller -80 ° C i 15 minutter eller mere end 3 timer for at hjælpe udfældning. Pelleten RNA ved centrifugering ved 4 ° C og 15.000 rpm i en table-top Eppendorf-centrifuge i 30 min. Fjern supernatanten og vask af bundfaldet med 70% EtOH, tryk med fingeren for at blande pellets godt. Pelleten RNA igen ved centrifugering ved 4 ° C og 15000 rpm i 30 min. Fjern supernatanten fuldstændigt ved pipettering og derefter tilsættes 40 ul hybridiseringsopløsning. Bland godt ved pipettering ind og ud. Sættes 1 ml af opløsningen i 3 ml Safety Løs opløsning i scintillationshætteglas, bland godt, og måle tællinger i scintillationstæller. Placere Eppendorf med riboproben ved -20 ° C til anvendelse inden for en uge. 3. Vævsbehandlingssammensætningen I en hætte, lav en frisk PBS buffer 4% paraformaldehyde opløsningen til omkring 3-5 ° C over stuetemperatur. Anbring objektglassene fra -80 ° C lagring i et metal rack på tøris, bære at arbejde plads under kølerhjelmen, og derefter placere rack i 4% paraformaldehydopløsning, og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask 3 gange i 1 x PBS omkring 15 dips hver (omkring 1 sekund pr dip). I hætten, gør acetylering buffer og ryst den kraftigt inden for 10 sekunder. Umiddelbart hældes i en bakke indeholdende tandstangen af ​​objektglas og inkuberes i 10 minutter, for at reducere baggrunden binding af riboprobe. Skylles 3 gange i 2 x SSPE i 15 dips. Dehydrer i 70%, 95% og 100% EtOH seriel i 2 min i hvert trin (behøver ikke at være i hætten). Tørre glider under hætten i mindst 10-15 minutter. 4. Hybridisering Beregn mængden af riboprobe (0.5-1 x 10 6 cpm pr slide) og hybridisering opløsning (100 gi pr slide) er nødvendig for alle dias. Preopvarme riboprobe-hybridisering blanding til 65 ° C i 5 minutter for at denaturere riboprobe. Afpipettér 100 ul-riboprobe-hybridisering løsning i en linje på tværs af dias, og bruge et dækglas til at sprede den jævnt over væv og dækglasset. Glassene anbringes horisontalt, vendende op til et metal stativ og et sted rack langsomt opretstående i 65 ° C oliebad i mindst 4 timer og højst 16 timer. Olien danner en lufttæt forsegling rundt om dækglas. Fjern metal stativer fra oliebadet og tør den overskydende olie omkring rack med silkepapir. Vask olie fra de omfattede dias og metal rack i glas eller metal bakker, der indeholder chloroform, to gange. Den 2. chloroform vask kan anvendes som den første til den næste eksperiment. Overfør rack med dækket glider ind i en bakke med i 0,1% β-mercaptoethanol + 2 x SSPE løsning og bevæge sig op og ned et par dips at løsne dækglas og fjerne opløse overskydende hybridisering såresolution. Overfør rack med dækket slides i frisk opløsning af 0,1% β-mercaptoethanol + 2 x SSPE, og derefter fjerne dækglas med en RNase gratis pincet i opløsning for at undgå ridser vævssnit. Overføre de udækkede glider i frisk tandstangen i en bakke vandret billede rack holderen, i en opløsning af 0,1% β-mercaptoethanol i 2 x SSPE. Inkuber stativet med glider i den friske 0,1% β-mercaptoethanol + 2 x SSPE-opløsning ved stuetemperatur i 1 time for at fjerne overskydende ubundet RNA-probe. Bortskaffe og de tidligere vandige vaskeopløsninger samt dækglas som radioaktivt affald. Overføre rack med glider på en forvarmet 2x SSPE-opløsning ved 65 ° C, tilsættes β-mercaptoethanol til en endelig koncentration på 0,1%, og inkuber ved 65 ° C i 1 time. Kassér som radioaktivt affald. Overførsel og inkuberes stativet med glider to gange i forvarmet 0,1 x SPPE ved 65 ° C i 30 minutter hver. Mængden af ​​radioaktivitet fjernesi dette trin er meget lille og ikke længere betragtes som overdreven radioaktivt affald efter dette trin. Dehydrer stativet og glider i 70%, 95% og 100% EtOH i 2 minutter hver. Tør dias i emhætten i mindst 30 min. 5. Visualisering af radioaktive signal Placer tørre dias i en film kassette og i et mørkt rum, x-ray film (Kodak Biomax MR film) placeres over dias, og luk kassetten. Sikre, at de glider vender emulsionen side af røntgenfilm. Udsætte dias i ~ 1-7 dage afhængig forventes overflod af udskrifter. Udvikle x-ray film i standard udvikler og fixer. Hybridiseringssignalet viser sig som sort (eksponerede sølvkorn i emulsionen) på filmen (fig. 1). (Valgfrit) Du kan finde cellulære opløsning og se signal på vævet, de dias skal dyppes i fotografisk emulsion og counterstained.. Hvis du vil i sidste ende kontrastfarve med cresylviolet, så delipidize sektioner ved inkubation i xylen i 5 minutter ved stuetemperatur to gange, rehydrere 1 min hver i 100%, 100%, 95%, 95%, 70% og 50% EtOH og derefter i deioniseret vand. Hvis man ikke vil farvning med et farvestof, som ikke kræver delipidization, så delipidization er ikke nødvendig. Tørre glider godt under en hætte i mindst 2-3 timer. I det mørke rum ved hjælp af en sikker lys, øse ud nok Kodak NTB-emulsion for at dække halv objektglasset længderetningen (dvs. væv) i glas dypning beholder, og derefter smelteblandes i en 42 ° C vandbad i 20-30 min. Derefter fortyndes den med destilleret vand til 1:1. Niveauet af emulsionen bør nu omfatte alle sektioner på et præparatglas, når glideren er dyppet i den. Hvis du har en masse dias, skal du muligvis forberede ekstra emulsion. Dip glider ind i fortyndede emulsion i 42 ° C vandbad og tørre dyppede objektglassene i en lukket lystæt container overnøjre i det mørke rum, eller i en ovn ved 37 ° C i 2-3 timer, med lysene slukket. Overfør objektglassene i stativer slots i sorte bokse, som indeholder desiccators og være omhyggelig med de dias, ikke at røre ved hinanden og dermed skabe artefakter. Forsegl kanten af ​​kasser med sort elektrisk tape langsomt for at forhindre statisk-inducerede lyse gnister og derefter wrap boksene i aluminiumsfolie. Opbevares i kasser ved 4 ° C fra adskillige dage til uger (signal fra 1 dag til røntgenfilm svarer til 5 dage under emulsion). Opvarme slide kasserne til stuetemperatur i 1 time. I mørkekammer, fjerne rack med dias (eller stedet, dias i en metal-rack, hvis du bruger kasser med dias slots) fra kasserne og udvikle dem i Kodak D-19 udvikleren på 16 ° C i 3,5 min. Vask de udviklede objektglas i ledningsvand ved stuetemperatur i 1 min. Glassene inkuberes to gange i fiksernatron ved 19 ° C i 6 minutter hver. Lys kan aktiveres ved den anden fixer inkubation. </li> Vask af objektglassene i rindende vand ved stuetemperatur i mindst 30 minutter og skraber emulsionen fra bagsiden af ​​objektglasset, medens "våde" med et barberblad til at forhindre ridsning glasset. Plet væv med 0,3% cresylviolet i ledningsvand i 5 minutter. Vask ekstra cresylviolet løsning i frisk vand fra hanen til ~ 15 dips. Dehydreres slides for ~ 15 dyk i de enkelte alkohol-opløsning: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% og 100% EtOH. Glassene inkuberes i xylen i 5 minutter ved stuetemperatur to gange. Dækglasset med Permount medium på dias og tørre dækket dias i hætten natten (> 16 timer), vil det tage flere dage, før limen er robust nok til at rense dias yderligere. 6. Generering Darkfield farvebilleder Om nødvendigt yderligere ren overskydende emulsion på bagsiden af ​​gliderne (ikke-coversliped side uden væv) ved befugtning med vand og skrabning med et barberblad. Skyl objektglassene med 80% EtOH løsning og tør 1-2 gange forsigtigt at slippe af med snavs og støv. Tag billeder under Darkfield eller lysfelt belysning. Trin 6.2 og 6.3 kan være nødvendigt at gentage 2-3 gange for at opnå en god billeder uden støvpartikler, som let kan ses i Darkfield under et dissektionsmikroskop. 7. Repræsentative resultater Det er to måder at anskue in situ hybridisering resultater på vævssnit hybridiserede med S 35 radioaktive prober: 1) x-ray film, der blev placeret over dias eller 2) emulsion, som blev belagt på dias. En tredje metode er at bruge en phosphorbilleddanner skærm placeret over dias, men vi har ikke været tilfreds med løsningen af ​​denne fremgangsmåde. X-ray film giver et hurtigt resultat og analyser af den generelle tilstand af hybridiseringen. X-ray film data viser også, bred anatomiske opløsning og kan anvendes til kvantitativ analysis 10. Eksempler på røntgenfilm billeder af sene aviært embryon hoveder hybridiseret med antisense-prober for FoxP1 og CoupTF2 genekspression er i figurerne 1A og B. Begge gener er meget udbredte i specifikke hjerneregioner underafsnit. En god kvalitet røntgenfilm resultat bør være skarp (ikke sløret) og har høj signal-til-baggrund-forholdet. Et sløret billede kan skyldes ujævn kontakt mellem en x-ray film og objektglasset med den hybridiserede væv. , Emulsion dyppede objektglas indeholder emulsionen lysfølsomme sølvsalte overtrukket på vævet som apposed til at være på plast af røntgenfilm. Under udvikling, S 35-eksponerede sølvsalte omdannes til metallisk sølv korn, ligesom i x-ray film. Imidlertid deponeret sølv er direkte synlige gennem de celler, der repræsenterer genekspression, der kan observeres og måles kvalitativt under et mikroskop. De metalliske sølvkorn blokere direkte lys through og fremstå som de sorte prikker under lysfelt udsigt. Den cresylviolet kontrastfarve vises violet (fig. 3A, 3C og fig. 4). I Darkfield, afspejler sølvkorn lys, der kommer fra siden og vist som hvide prikker (fig. 1C, 1D, 3B og 3D). I denne situation forekommer cresylviolet farves rød. I brightfield er hybridiseringssignalet lettere at se under stor forstørrelse ved cellulær opløsning, hvorimod Darkfield desuden kan hybridiseringssignalet ses under lavere forstørrelse hele væv. Den Darkfield opfattelse er den tilgang, vi normalt bruger til at vise den samlede genekspression mønster. Imidlertid, i forhold til hurtig resultatet af røntgenfilm, emulsions dyppede objektglassene tager længere tid (en til flere uger) og er mere følsom for at opnå baggrund. Der er fire almindelige kilder til stærk baggrund: 1) Baggrund hele røntgenfilm sædvanligvis lave to problemer med bygherren eller fixer eller delvist eksponeret film, 2) Baggrundsoplysninger om objektglas er normalt på grund af problemer med vask eller glas præparatet, såsom forkert silination dias fra den kommercielle kilde eller selvstændige forberedt, 3) Emulsion eksponering og fremkaldelse baggrund og 4) Baggrund for afsnittet skyldes enten manglende omhyggelig post-hybridiserings vasketrin, for lav en hybridiseringstemperatur, dårlig kvalitet hybridiseringsopløsningen, paraformaldehyd kontaminering i vaskemidler forårsager prober til permanent kryds- link til vævet, riboprobe nedbrydning fører til små molekyler etikettering vævet ikke-specifikt, inaktive DTT eller β-mercaptoethanol resulterer i tværbinding af S 35-RNA-prober in di-sulfid bindinger til vævet, og venter for længe acetylering. Er det vigtigt at have objektglas i acetyleringen opløsningen i løbet af sekunder fra blanding af eddikesyreanhydrid og triethanolamin. Hvis flere minutter passere medud tilsætning af opløsningen til siderne acetylgrupperne vil da ikke blive effektivt fjernet, og derefter binde til RNA ikke-specifikt. Andre faktorer indbefatter hybridisering i 20 timer, hvilket kan skabe for stor af et signal, og overskydende oliesmådråber på objektglas, som sekvestrerer hybridiseringsopløsning på objektglas under vandige vaskevæsker, hvilket resulterer i radioaktive pletter på vævet og glider give mørk baggrund signaler. Hvis du arbejder med mange slides (mere end 100 skiver), tilføje en 3 tredje chloroform vaske eller ændre kloroform vaske, for at forhindre overskydende olie partikler i at forblive på dias. Careless væv behandling, dvs ikke fryse hurtigt nok (inden for 5-10 min efter dissektion) eller optøning og re-frysning øger også baggrunden på grund af mRNA nedbrydning. Vær forsigtig med ikke at forveksle baggrunden for overeksponering. For emulsion baggrund på de dyppede dias er muligt, fordi det er meget lysfølsomt og kræver lang eksponering i mørke. C FÆLLES baggrund problemer omfatter for høj temperatur for bygherren og fixer. Når temperaturen er højere end 19 ° C, tæt på eller varmere end stuetemperatur, mere sølv korn baggrund opnået. Udsættelse for lave niveauer af lys siver ind i et mørkekammer vil forårsage emulsion baggrund. Ikke udvaskes fiksernatron lang nok (mindst 30 minutter i rindende vand), vil forlade fiksernatron, som derefter reagerer med cresylviolet at generere en brunlig bundfald hele emulsionen. Men hvis objektglassene vasket i vand længere end 90 minutter efter fiksering før cresylviolet farvning, kan dette forårsage emulsionen bliver løs og afsnittene til farvning dårligt. Hvis der ikke er tid nok til at plette objektglassene i en 30-90 minutter vindue efter fiksering og vask, efter 30 min vask, tørring objektglassene natten over og gå videre med cresylviolet farvning næste dag. Generelt vil de fleste mRNA'er har specifikke genekspressionsmønstre, hvorimod baggrundssignal er mere ensartet. ove_content "> foldet væv kan være vildledende for genekspression resultaterne på røntgenfilm, hvilket fører til en region med mørkere signal. at bestemme, om vævet er foldet, behandle ikke-farvede snit under Darkfield eller cresylviolet farvede sektioner under brightfield. Cresyl violet kontrastfarvning giver en bedre måde at undersøge vævet tilstand. For en bedre fortolkning af sonde specificitet, bør kontrol sense sonder anvendes på flere tilstødende sektioner. Mest mening sonder viser ikke et signal, men nogle gør, og når de gør det, vi finder, at det ofte er anderledes end det antisense-signal. Vi mener, at dette kunne være relateret til antisense-syntese eller et andet gen på antisense-strengen af ​​genomet. Vi præsenterer et eksempel Pax6 sense-og antisense-prober (fig. 2A og B). Antisense-strengen viser mærkning langs den ventrikulære zone af forhjernen, cerebellum og øjet som forventet (fig. 2A), men den forstand afslørermærkning i pigmentet lag af nethinden (fig. 2B). For probe størrelser, bruger vi cDNA-prober som helst i området fra 300-5000 bps. Prober mindre end 300 bps arbejde, men signalerne er sædvanligvis svagere. Vi har ikke prøvet sonder større end 5000 bps. Det er bedst at anvende prober på væv fra den samme art, hvis muligt. Hvis ikke, vi krydshybridiserer sonder på dele af andre arter og mindske hybridisering og vask temperaturer i 3-5 ° C intervaller baseret på sekvens identitet, hvis kendt. Hvis ikke er kendt, så vi udfører trial and error hybridisering og vask temperaturer. Hvis temperaturen sænkes for meget, kan cDNA-proben krydshybridiserer med andre mRNA'er af lignende sekvenser på tværs af arter eller i de samme arter 11. I praksis finder vi, at cDNA'er, der ~ 95% identisk med eller større for mRNA-mål i vævet, den stringente hybridiserings-og vasketemperatur (65 ° C) betingelser fungerer godt. For sekvenser, der er i ranges af ~ 85 til 94% identiske, hybridiserings-og vasketemperatur muligvis reduceres i området fra -50 til 60 ° C. Grunden til anvendelse af et metal rack i de fleste trin er anvendelsen af ​​chloroform vaske og xylen. Begge organiske smelte mange typer plast. Glas og visse typer plastmaterialer er resistente over for disse organiske forbindelser. Men glas er lettere at bryde, og nogle plastik, som i første omgang er resistente vil smelte i løbet af lang-perioder af eksponering for økologi. Figur 1. Autoradiografi af in situ-hybridisering billeder fra x-ray film og emulsions dyppede lysbilleder. (AB) røntgenfilm billeder af sagittale hele hovedet sektioner zebra Finch sangfugl ved embryonisk dag 10, hybridiseret med antisense riboprober til (A) FoxP1 eller (B) CoupTF2, taget med lysfelt belysning under et dissektionsmikroskop. Sort, eksponerede kerner i filmen viser mRNA expression. Målestokken = 500 um. (CD) emulsion dyppet lysbilleder af sagittale hele hovedet dele af zebra Finch den efterfølgende luge dag 6, hybridiseret med antisense riboprober til (C) FoxP1 og (D) CoupTF2, taget med Darkfield belysning under en dissektion mikroskop. Hvid, eksponerede sølvkorn i emulsion over væv viser mRNA ekspression. Rød, cresylviolet farvestof. Målestokken = 200 um. For alle billede, er næbbet rostralt til venstre. De røntgenfilm billeder blev eksponeret for en dag, dyppet objektglassene i 3 dage. Den FoxP1 probe er 178 bp til 1544 til 1711 bp del af mRNA, CoupTF2 er 545 bps til 1-545 bp del af mRNA'et. Som det kan ses, i forhjernen FoxP1 mRNA er beriget i mesopallium (M), striatum (St) og dorsal thalamus (DT), hvorimod CoupTF2 er beriget i nidopallium (N), arcopallium (A), og mere ventrale thalamus . Der er sammenhæng i udtryk mellem eksponering typer (og alder). Med de dyppede objektglas, der imidlertid en højere opløsning mærkning ses,og væv grænselinjerne og underafsnittene er direkte identificeret. Disse og alle andre billeder, der vises i papiret er fra sektioner ved hjælp af standard 65 ° C høj stringens hybridisering. Figur 2. Sammenligning af antisense-og følelse mærkning, der viser forskellige mønstre. (A) antisense-strengen af ​​Pax6 blev udtrykt i hjernen, især den ventrikulære zone (hvid pil). Vist er autoradiografi på x-ray film sagittale hele hovedet skiver taget fra Zebra Finch ved embryonal dag 12. (B) tilstødende sektion hybridiseret med sense-strengen af ​​Pax6 afslører ingen baggrund ekspression i hele embryo hovedet, men tilsyneladende ekspression i pigmentet lag af nethinden (sorte pile) som antisense-strengen. Den stiplede linje angiver konturen af ​​hele hjernen. C: cerebellum. < strong> Figur 3. In situ signaler af genekspression i slam dyppede dias taget fra zebra finke hjernen under sene embryonale stadier under lysfelt og Darkfield synspunkter. (A) brightfield billede af D1B ekspression på embryonisk dag 10 fra en normal eksponering for emulsionen. Etiketten (sort) kan næsten ikke ses på denne forstørrelse. Proben er 625 bps til 1-625 bp del af mRNA'et. (B) Identiske tværsnit og forstørrelse som i (A), men skiftede til Darkfield visende etiket (hvid) i striatum (St) og thalamus (TH). (C) brightfield billede af Slit3 ekspression på embryonisk dag 12 fra en overeksponering til emulsionen. Etiket (sort) let kan ses. Proben er 779 bp til 1243 til 2021 del af mRNA'et. (B) Identiske tværsnit og forstørrelse som i (A) koblet til Darkfield visende etiket (hvid) i rygmarven (SC), der passer til brightfield billedet. Rostral er orienteret til venstre. CB: cerebellum. ad/3764/3764fig4.jpg "alt =" Figur 4 "/> Figur 4. Silver korn opløsning på celleniveau. Vist er FoxP1 mRNA etiket zebraen bomlærken forhjernen med sølvkorn (sorte pletter) ovennævnte celler (cresylviolet) i forskellige hjerneområder og alder sammenlignet med lavere effekt billeder af figur 1A og 1C. (A) med høj tæthed ekspression over individuelle celler (sorte pile) i voksne zebra Finch mesopallium. (B) lav tæthed ekspression over individuelle celler (sorte pile) i det tilstødende nidopallium af den samme sektion. (C) Høj FoxP1 mRNA-ekspression i celler (sorte pile) i den embryoniske dag 12 mesopallium. (D) lav tæthed ekspression i celler (sorte pile) i det tilstødende nidopallium af den samme sektion. Eksempel celler cirklede med en gul streg. Embryonale celler (C og D) er mindre og mere tæt pakket i forhold til voksne celler (A og B). Den eftersom der er en vis afstand mellem cellerne og emulsionsstabilisatorer, området eksponeredesølvkorn fra S 35 proben er lidt større end arealet af cellelegemer. Målestokken = 10 um.

Discussion

Radioaktivt in situ hybridisering af mRNA-ekspression er meget udbredt til flere formål, herunder til at studere regionale væv organisation, celletyper, og hjernen funktionel aktivitet ^{2-5,10,12-14.} Den senere brug ligger på gener, hvis mRNA-ekspression i hjernen er afhængig forøget neural aktivitet, ofte kaldet aktivitet afhængige gener eller umiddelbare tidlige gener. Med disse anvendelser, er vores metode blevet anvendt på tværs af flere arter, herunder fugle, pattedyr (fx mennesker), fisk og padder i flere væv, herunder hjerne, hud og muskler, og flere aldre, herunder hatchlings / nyfødte, unge , voksne, og her i hele embryo sektioner ^2,3,5,15-17. De særlige kendetegn ved vores protokol omfatter: (1) Det giver en balance mellem anatomisk specificitet og kvantitativ specificitet. At kvantificere genekspression på x-ray film, vi tager digitale billeder af billederne (ex:. Figur 1A og 1B), skal du bruge Photoshop (Adobe) histogram funktion at måle pixeltæthed i områder af interesse og subtrahere de baggrundsniveauer på filmen ydersiden af væv, men stadig på objektglasset ^2,4. For at kvantificere ekspression på cellulært niveau, vi tager billeder af sølvkorn over celler under stor forstørrelse (40-100X, Fig 4). Vi bruger derefter tærsklen og måle funktioner af Image J af Wayne Rasband ved NIH for at tælle antallet af sølvkorn i billedet, trække ud i baggrunden tæller i et lignende område uden celler på objektglasset, dividere med antallet af celler, til opnåelse af en værdi for ekspression per celle. ^4,18 (2) kan være relativt højt gennemløb, således at behandling af 100-200 objektglas samtidigt på grund af den tætte dækglasset forsegling af mineralsk oliebad. Standard in situ-hybridisering metoder til at tage længere tid at forsegle dias med parafilm, neglelak og andre midler, når dias tage en masse plads, (3) Det er megetfølsomme for lav hyppighed transkripter grund dextransulfat og Denhardts opløsning i hybridiseringspuffer ^2,13 (4) Den billeddannende fremgangsmåde i Darkfield giver høj kontrast på grund af optagelse af billeder under Darkfield belysning på et dissektionsmikroskop ^4,5. Desuden er det muligt sensitiv påvisning af små ændringer i genekspression, såsom aktiviteten-afhængig genekspression til at identificere specifikke hjerneregioner aktiveres under perception og produktionen af specifikke adfærdstyper ^19. Begrænsninger i forhold til ikke-radioaktive protokoller er at sidstnævnte er tydeligere i det cellulære opløsning og placeringen af ​​mRNA i cellen, og arbejdet med emulsion er meget følsom for manipulation og lys. Det er muligt at kombinere vores fremgangsmåde med andre metoder, såsom ikke-radioaktiv in situ-hybridisering til at betegne mRNA-ekspression af mere end ét gen i det samme væv ^10,17,20. Det kan kombineres med immunocytokemitil at mærke både RNA og proteinekspression på den samme prøve med henblik på at co-lokalisere mRNA med visse celletyper ^10. Protokoldataenhederne modifikationer er nødvendige for sådanne dobbelt mærkning forsøg er beskrevet i de citerede referencer.

Sammenfattende muliggør vores fremgangsmåde forståelse af timingen og cellulære placering af genekspression, således at forstå region organisation, væv funktionel aktivitet, og genfunktion.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Acetic anhydride	VWR	MK242002
Chloroform	VWR	BDH1109
Cresyl violet acetate	Sigma	C5042
Cryostat	Thermo scientific	Microm HM550
Deionized formamide	Sigma	F9037
DTT	Promega	P1171	100mM
EDTA	Sigma	ED
Embedding mold	VWR	15160-215
Fisher brand Superfrost plus slide	Fisher Scientific	22-034-979
Formaldehyde	VWR	BDH0506-4LP
Formamide	Sigma	F7508
GENECLEAN kit	Q-Bio gene	1001-200
Kodak BioMax MR film	Sigma	Z350370
Kodak NTB Emulsion	Carestream Health	8895666
Kodak Professional developer D19	Kodak	1462593
Kodak professional Fixer	Kodak	1971746
β-mercaptoethanol	Calbiochem	444203
Mineral oil	VWR	IC15169491
NaOH	VWR	SX0600-1
Paraformaldehyde	Sigma	76240
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
rATP	Promega	P1132	10mM
rCTP	Promega	P1142	10mM
rGTP	Promega	P1152	10mM
RNasin	Promega	N2111	40Units/μl
S35 UTP	PerkinElmer	NEG039C001MC
Safety-Solve solution	Safety Solve Research Products International	111177
Sodium Acetate	Sigma	S7899	3M
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S3139
SP6 RNA polymerase	Promega	P1085
Staining metal rack	Electron Microscopy Sciences	70312-54
T7 RNA polymerase	Promega	P2075
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
5x Transcription buffer	Promega	P1181
Triethanolamine	VWR	IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	VWR	101449-446
tRNA	Roche	10109509001

Solutions:

1. Reagents for making of riboprobes: 1.5 μl DNA template (0.2-0.3 μg/μl), 2 μl of 5x optimized transcription buffer, 1 μl of 100mM DTT (comes with Polymerase from Promega, mix well at room temperature), 0.3 μl of RNasin (40 units/μl), 1.5 μl of AGC ribonucleotide mix solution, 3.5 μl of S³⁵ UTP, and 1 μl RNA polymerase. Bring up to 10 μl with nuclease-free water.
2. AGC ribonucleotide mix solution: mix equal amounts of 10mM ATP, GTP and CTP together.
3. Sodium acetate solution for EtOH precipitation to remove free S³⁵ UTP: 40 μl RNase and DNase free water, 5 μl of 3M Sodium Acetate, and 125 μl of 100% EtOH.
4. Hybridization buffer (10ml stock): 5 ml of 100% deionized formamide, 600 μl of 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8.0), 240 μl of 0.5M EDTA (pH =8.0), 100 μl of 100x Denhart’s solution, 100 μl of 1M DTT, 250 μl of 20mg/ml tRNA, 125 μl of 20 mg/ml poly A, and 1 g of Sodium Dextran Sulfate. Add DEPC-treated water to bring the total volume to 10 ml. Shake vigorously and then incubate at 55°C until all sodium dextran sulfate is dissolved. Store the hybridization buffer in -20°C, which is good for ~6 months.
5. 4% buffered paraformaldehyde solution: Add 40 g of paraformaldehyde in 760 ml distilled water in a flask designated for paraformaldehyde, heat to 50°C on a hot plate while stirring. Add 320 μl of 10N NaOH to help dissolve the paraformaldehyde. After dissolving (~10 min), add 100 ml of 10x PBS, and bring the volume up with distilled water until 1 liter. Stir and heat the solution until paraformaldehyde is dissolved. The pH should be 7.4.
6. Acetylation buffer: 13.6 ml of triethanolamine plus 2.52 ml of acetic anhydride in 1 liter of distilled water.
7. 20x SSPE solution: 3M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄-H₂O, and 200 mM EDTA in distilled water. Adjust solution to pH 7.4 with 10N NaOH.
8. 10x PBS buffer: 80g of NaCl, 2.0g of KCl, 14.4g of Na₂HPO₄, and 2.4g of KH₂PO₄ in distilled water. Adjust solution to pH 7.0 and bring total volume to 1 liter.
9. Second wash solution: 0.1% β-mercaptoethanol and 50% formamide in 2x SSPE
10. Cresyl violet acetate solution: 3% cresyl violet acetate in tap water (distilled water prevents good staining), dissolved overnight with stirring in a flask at room temperature. Filter with vacuum suction through a 1mm Whatman filter paper and Buchner funnel.