Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

Published: April 27, 2012 doi: 10.3791/3764
Automatic Translation
1, 2, 1
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

Summary

פרוטוקול זה משמש בהצלחה כמותית לזהות רמות ודפוסים מרחביים של ביטוי mRNA של מספר סוגי רקמות על פני בעלי החוליות. השיטה יכולה לזהות תעתיקי שפע נמוך ומאפשר עיבוד של מאות שקופיות בו זמנית. אנו מציגים את הפרוטוקול באמצעות פרופיל הביטוי של היווצרות העופות המוח העוברי כדוגמה.

Abstract

לדעת את העיתוי, ברמה, לוקליזציה נייד, ואת סוג התא הגן מתבטא תורם להבנתנו את הפונקציה של הגן. כל התכונות הללו ניתן להשיג עם ההכלאה ב באתרו כדי mRNAs בתוך התאים. כאן אנו מציגים רדיואקטיבי בשיטת הכלאה באתרו שונה מ קלייטון et al. (1988) 1, כי עובדת בהצלחה במעבדה שלנו במשך שנים רבות, במיוחד שכל בעלי חוליות בוגרים 2-5. הארוכים משלימים RNA (קרנה) בדיקות רצף היעד מאפשר זיהוי של תמלילי שפע נמוכות 6,7. שילוב הנוקליאוטידים רדיואקטיביים לתוך בדיקות קרנה מאפשר רגישות גילוי נוסף של תמלילי שפע נמוכות ניתוחים כמותיים, או על ידי סרט אור רנטגן רגיש או תחליב מצופה על הרקמה. אלה שיטות זיהוי לספק תיעוד ארוך טווח היעד של ביטוי גנים. לעומת הלא רדיואקטיבי בדיקה ספידODS, כגון DIG-תיוג, שיטת בדיקה רדיואקטיבית ההכלאה אינו מחייב צעדים הגברה מרובים באמצעות HRP נוגדנים ו / או ה-TSA ערכת לגילוי תמלילי שפע נמוכים. לכן, שיטה זו מספקת יחס ליניארי בין עוצמת האות לבין כמות ה-mRNA ממוקדים על ניתוח כמותי. הוא מאפשר עיבוד 100-200 שקופיות בו זמנית. זה עובד גם על שלבי ההתפתחות השונים של העובר. מחקרים התפתחותיים ביותר של ביטוי גנים משתמשים עוברים שלמים שאינם רדיואקטיביים גישות 8,9, בין השאר בשל הרקמה העוברית היא שברירית יותר רקמת מבוגר, עם פחות לכידות בין תאים, ולכן קשה לראות את הגבולות בין אוכלוסיות תאים עם קטעי רקמה. לעומת זאת, הגישה שלנו רדיואקטיבי, בשל מגוון גדול יותר של רגישות, הוא מסוגל להשיג ניגודיות גבוהה יותר בהחלטה של ​​ביטוי גנים בין אזורים רקמות, מה שמקל לראות הגבולות בין האוכלוסיות. באמצעות שיטה זו, החוקרים יכלו לחשוף אתמשמעות אפשרית של הגן המזוהה החדש, ובהמשך לחזות את הפונקציה של הגן של עניין.

Protocol

1. רקמת הכנה

  1. למסוק רקמות חדשות. עבור עוברי העופות, הביצים בזהירות לפתוח ולנקות את העובר בצלחת עם 1xPBS, פעמיים. עבור מוחות בוגרים, להסיר במהירות את המוח בעדינות ולשטוף עם 1 X PBS.
  2. עוברים שבץ מוח או מבוגר לתוך תבנית מוטבע מלא אוקטובר רקמות Tek, orientating רקמה לפי הצורך עבור חתך, ומהר להקפיא את גוש ידי הצבתו בתוך אתנול תערובת קרח יבש, נזהר שלא לקבל את התערובת בתוך בלוק .
  3. פורסים את המדגם קפוא cryostat תוך 10-12 חלקים עבים מיקרומטר. על רקמת המוח העוברי, ממוזג חיתוך הטובה ביותר היא בטווח של -18 ° C עד -20 ° C.
  4. הר חלקים קפואים בשקופיות סופר פלוס זכוכית.
  5. אחסן את הסעיפים תיבת שקופיות ב -80 ° C.

2. דור של Riboprobes רדיואקטיביים (השתמש בטיחות קרינה נהלי המוסד שלך)

  1. צור ד.נ. ליניארי מטוהריםתבנית של עניין cDNA שלך או על ידי האנזים לעכל מוגבל של שבר משובטים מוקף האמרגן רנ"א פולימראז אתרים מ-DNA פלסמיד או PCR של הכנס המצורפת מקדם אתרים RNA פולימראז מחייב. ניתן גם ליצור קטעי ה-PCR עם היזמים RNA פולימראז כחלק 3 'ו 5 "ה-PCR primers. ג'ל לטיהור שברי מוגבל או PCR שלך שנוצר עם ערכת ג'ל GENECLEAN טיהור.
  2. כדי צינור 0.5 Eppendorf מ"ל, להוסיף 0.5-1 מיקרוגרם של מטוהרים תבנית ה-DNA ליניארי, מאגר שעתוק, DTT, RNasin, הפתרון AGC תערובת נוקלאוטידים, ומים RNase חופשית להביא את עוצמת הקול עד לגובה הרצוי. לאחר מכן הוסף S 35-UTP ו-RNA פולימראז המתאימה לעשות לא riboprobes antisense או הגיוני.
  3. דגירה התערובת במשך שעה 1 ב 37 אמבט המים C °. הוסף aliquot של פולימראז רנ"א דגירה של שעה 1 אחר.
  4. הוסף אצטט 3M נתרן פתרון (0.1 פי נפח הכל) ו 100% EtOH (2.5 FOהנפח הכולל של LD) לתוך צינור Eppendorf כדי להאיץ riboprobe מסונתז רנ"א.
  5. דגירה בקרח יבש או -80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או יותר מ -3 שעות כדי לסייע משקעים.
  6. גלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C, 15,000 סל"ד בצנטריפוגה Eppendorf בטבלה העליונה למשך 30 דקות.
  7. הסר את supernatant ולשטוף גלולה עם EtOH 70%, לחץ באצבע לערבב היטב גלולה.
  8. גלולה RNA שוב על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C, 15,000 סל"ד למשך 30 דקות.
  9. הסר את supernatant לחלוטין pipeting ולאחר מכן להוסיף 40 הפתרון הכלאה μl. מערבבים היטב על ידי pipeting פנימה והחוצה.
  10. שים 1 μl של פתרון בפתרון 3 בטיחות לפתור מ"ל תערובת הבקבוקון, נצנץ ובכן, ולמדוד את סעיפים ב למונה הנצנץ.
  11. מניחים את Eppendorf עם riboprobe ב -20 ° C לשימוש בתוך שבוע.

3. טיפול רקמות

  1. על מכסה המנוע, להכין טרי PBS שנאגרו paraformaldehy 4%דה פתרון על 3-5 מעלות מעל טמפרטורת החדר. שקופיות המקום -80 ° C אחסון במעמד מתכת על קרח יבש, לשאת לעבוד בחלל מתחת למכסה המנוע, ולאחר מכן למקם את מתקן בפתרון paraformaldehyde 4% ו דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף 3 פעמים ב 1 x PBS כ -15 מטבלים כל אחד (כ 2 1 לכל מח"ש).
  3. בשכונה, לעשות חיץ acetylation ולנער אותו נמרצות תוך 10 שניות. מיד שופכים למגש המכיל את המדף של שקופיות ו דגירה של 10 דקות, כדי להפחית את הרקע המחייב של riboprobe.
  4. יש לשטוף 3 פעמים ב 2 x SSPE 15 מטבלים.
  5. מייבשים ב 70%, 95% ו 100% סדרתי EtOH דקות 2 בכל צעד (לא חייב להיות מכסה המנוע).
  6. לייבש את השקופיות מתחת למכסה המנוע דקות לפחות 10-15.

4. הכלאה

  1. חישוב כמות riboprobe (0.5-1x10 6 עותקים לדקה לכל שקופית) פתרון ההכלאה (100 μl לכל שקופיות) שקופיות את כל הדרוש. Prewaתערובת RM-riboprobe הכלאה עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל riboprobe.
  2. 100 Pipet μl של פתרון riboprobe-הכלאה בשורה לרוחב שקופיות, ולהשתמש coverslip זכוכית להפיץ אותו באופן שווה על פני רקמת ו coverslip. מקום מחליק באופן אופקי, מול זקוף לתוך מתקן מתכת מתלה המקום לאט זקוף לתוך אמבט 65 ° C הנפט עבור מינימום של 4 שעות ועד למקסימום של 16 שעות. הנפט יוצרת חותם אטום סביב coverslips את.
  3. הסרת מדפי מתכת מהאמבטיה שמן ולנגב את עודפי השמן סביב המדף עם נייר טישו.
  4. לשטוף את השמן מן השקופיות מכוסים ו מתלה מתכת מגשי זכוכית או מתכת המכילים כלורופורם, פעמיים. 2 nd כלורופורם לשטוף יכול לשמש הראשון לניסוי הבא.
  5. להעביר את המדף עם שקופיות מכוסים למגש עם ב 0.1% β-mercaptoethanol פתרון + 2 SSPE x ו לעלות ולרדת כמה מטבלים מעט כדי לשחרר coverslips ולהסיר לפזר הכלאה Solu עודףtion.
  6. להעביר את המדף עם שקופיות מכוסים בתמיסה חדשה של 0.1% β-mercaptoethanol + 2 x SSPE, ולאחר מכן הסר coverslips עם כ מלקחיים RNase חופשי הפתרון למניעת גירוד סעיפים רקמות. להעביר את השקופיות וחשפה למעמד טרי בעל שקופיות אופקי מגש מתלה, בתמיסה של 0.1% β-mercaptoethanol ב 2 x SSPE.
  7. דגירה מתלה עם שקופיות mercaptoethanol-β טריים 0.1% + 2 x פתרון SSPE בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 כדי להסיר עודפי מאוגד RNA בדיקה. מחק את זה ואת הפתרונות הקודמים לשטוף מימית, כמו גם coverslips, כמו פסולת רדיואקטיבית.
  8. להעביר את המדף עם שקופיות פתרון prewarmed SSPE 2x ב 65 ° C, להוסיף β-mercaptoethanol כדי הסופי של ריכוז 0.1%, ו - דגירה על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. מחק כמו פסולת רדיואקטיבית.
  9. להעביר דגירה מתלה עם שקופיות פעמיים ב prewarmed 0.1 x SPPE על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כל אחד. כמות רדיואקטיביות מוסרשלב זה הוא קטן מאוד נחשב עוד פסולת רדיואקטיבית מוגזמת לאחר שלב זה.
  10. מייבשים ארונות שקופיות ב 70%, 95% ו 100% EtOH 2 דקות כל אחד.
  11. לייבש את השקופיות בשכונה דקות לפחות 30.

5. ויזואליזציה של אות רדיואקטיבי

  1. מניחים שקופיות היבשים לתוך קלטת סרט בחדר חשוך, הצב את רנטגן הסרט (קודאק BioMax MR הסרט) על השקופיות, ולסגור את הקלטת. ודא השקופיות עומדים בפני צד האמולסיה של הסרט X-ray. לחשוף את השקופיות עבור ~~~HEAD=NNS 1-7 ימים, בהתאם השפע הצפוי של תעתיקי את.
  2. לפתח את הסרט רנטגן מפתח Fixer רגיל. האות הכלאה מופיע בתור שחור (חשופים דגנים כסף ב אמולסיה) על הסרט (איור 1).
    1. (אופציונלי) כדי לקבוע את הרזולוציה הסלולר ולראות אות על הרקמה, השקופיות צריך להיות טבול תחליב צילומי counterstained.אם אתה הולך בסופו של דבר counterstain עם סגול cresyl, אז delipidize סעיפים ידי דוגרים על קסילן במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר פעמיים, rehydrate 1 דק 'כל אחד 100%, 100%, 95%, 95%, 70% ו 50% EtOH ואז במים deionized. אם אתה לא הולך עם כתם צבע שאינו דורש delipidization, אז delipidization אין צורך. מגלשות יבשות גם תחת מכסה המנוע לפחות 2-3 שעות.
    2. בחדר החושך באמצעות האור בטוח, לגרוף את מספיק קודאק NTB תחליב לכסות במחצית שקופיות לאורכו (כלומר רקמות) במיכל זכוכית טבילה, ואז נמס אמבט 42 ° C מים במשך 20-30 דקות. ואז לדלל אותה במים מזוקקים יחס 1:1. רמת תחליב אמור לכסות את כל החלקים בשקופית כאשר השקופית הוא טבל בו. אם יש לך הרבה שקופיות, ייתכן שיהיה עליך להכין תחליב נוסף.
  4. מטבל לתוך שקופיות אמולסיה בדילול מלא ב 42 ° C אמבט מים ומגלשות טבל יבשים במיכל סגור היטב באור overnigHT בחדר חשוך, או בתנור על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות, עם אורות כבויים.
  5. להעביר את השקופיות לתוך חריצי מתלים בקופסאות שחורות המכילות הייבוש, נזהר על השקופיות לא לגעת זה בזה וכך ליצור חפצים. סוגרים את הקצוות של תיבות עם הקלטת חשמל שחור לאט כדי למנוע חשמל סטטי המושרה ניצוצות אור, ואז עוטפים את הקופסאות בנייר אלומיניום. אחסן את תיבות על 4 מעלות צלזיוס החל מספר ימים עד שבועות (האות מיום 1 על הסרט X-ray דומה 5 ימים תחת אמולסיה).
  6. לחמם את תיבות שקופיות לטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
  7. בחדר החושך, להסיר מתלה עם שקופיות (או שקופיות מקום במעמד מתכת אם באמצעות תיבות עם חריצי שקופיות) מן הקופסאות ולפתח אותם מפתח D-19 קודאק ב 16 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות.
  8. לשטוף את השקופיות שפותחו במי ברז בטמפרטורת החדר למשך דקות 1.
  9. דגירה השקופיות פעמיים Fixer ב 19 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות כל אחד. אורות ניתן להפעיל במהלך הדגירה מסדר 2. לשטוף את השקופיות במים זורמים בטמפרטורת החדר למשך דקות לפחות 30 ולהתרפס תחליב מהצד האחורי של המגלשה תוך "רטוב" עם סכין גילוח כדי למנוע גירוד הזכוכית.
  10. כתם סגול עם רקמת cresyl 0.3% במי ברז במשך 5 דקות.
  11. לשטוף סגול נוספת פתרון cresyl במי ברז טריים ~~~HEAD=NNS 15 מטבלים.
  12. מייבשים את השקופיות עבור ~~~HEAD=NNS 15 לתנודות כל פתרון אלכוהול: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% ו 100% EtOH.
  13. דגירה של שקופיות קסילן 5 דקות בטמפרטורת החדר פעמיים.
  14. Coverslip עם המדיום Permount בשקופית ולייבש את השקופית מכוסה בברדס הלילה (> 16 שעות), זה ייקח כמה ימים לפני כן דבק הוא יציב מספיק כדי לנקות את השקופיות יותר.

6. יצירת תמונות darkfield צבע

  1. אם יש צורך, נוסף תחליב עודף נקי על הגב של השקופיות (לא coversliped הצד ללא רקמות) על ידי להרטיב אותו במים מגרדים בסכין גילוח.
    2. <li> יש לשטוף שקופיות עם פתרון EtOH 80% ולנגב בעדינות 1-2 פעמים כדי לסלק פסולת ואבק.
  2. לצלם מתחת darkfield או brightfield תאורה. צעדים 6.2 ו 6.3 ייתכן שיהיה צורך לחזור 2-3 פעמים על מנת לקבל תמונות טובות ללא חלקיקי אבק, אשר ראו בקלות תחת מיקרוסקופ הביתור darkfield.

7. נציג תוצאות

שתי דרכים עיקריות של צפייה בתוצאות הכלאה באתרו על סעיפים רקמות הכלאה עם S 35 בדיקות רדיואקטיביות: 1) x-ray סרטים שהונח על שקופיות או 2) תחליב שהיה מצופה על השקופיות. הגישה השלישית היא באמצעות מסך phosphorimager הונחה על השקופיות, אבל לא היה מרוצה עם רזולוציה של גישה זו. X-ray סרטים לספק תוצאה מהירה וניתוח של המצב הכולל של ההכלאה. צילום רנטגן הסרט חושף גם נתונים ברזולוציה אנטומי רחב והוא יכול לשמש analys כמותייםהוא 10. דוגמאות רנטגן תמונות סרטים של סוף שנות ראשי העובר העופות הכלאה עם בדיקות antisense לביטוי FoxP1 ו CoupTF2 הגן הם במספרים 1 א 'וב'. שני גנים נפוצים מאוד חלוקות משנה מוח ספציפיים. באיכות טובה רנטגן בעקבות הסרט צריכה להיות חדה (לא מטושטשת) ויש להם יחס גבוה אות הרקע. תמונה מטושטשת יכול להיות בגלל מגע לא אחיד בין הסרט x-ray ו שקופיות זכוכית עם רקמת הכלאה.

עבור שקופיות תחליב טבל, תחליב מכיל אור מלחי כסף רגישים מצופים על רקמות כמו apposed להיות על הפלסטיק של הסרט X-ray. במהלך פיתוח, את 35 שנחשפו מכלל מלחי כסף מומרים מתכתי גרגרי כסף, ממש כמו בסרט X-ray. עם זאת, מרבצי כסף גלויים ישירות על התאים המייצגים ביטוי גנים שניתן לצפות ומדד איכותית תחת מיקרוסקופ. גרגרי כסף מתכתי לחסום אור ישיר דרךונראה כמו נקודות שחורות תחת התצוגה brightfield. Counterstain סגול cresyl מופיע בצבע סגול (איור 3 א, 3 ג, ו איור. 4). ב darkfield, גרגרי כסף משקפים אור מגיע מהצד נראה כמו נקודות לבנות (איור 1 ג, 1D, 3B ו 3D). במצב זה, סגול cresyl הכתם מופיע בצבע אדום. ב brightfield, האות הכלאה קל יותר להציג בהגדלה גבוהה ברזולוציה הסלולר, בעוד darkfield, בנוסף, האות ההכלאה ניתן לצפות בהגדלה נמוכה יותר על פני הרקמה כולה. צפה darkfield היא הגישה שאנו בדרך כלל להשתמש כדי להראות את הדפוס הכללי ביטוי גנים. עם זאת, ביחס לתוצאות מהירה המתקבל x-ray סרטים, את השקופיות תחליב טבל לוקח זמן רב יותר (1 עד מספר שבועות) והוא רגיש יותר לקבל רקע.

ישנם ארבעה מקורות נפוצים של רקע חזק: 1) רקע על כל סרט צילום רנטגן הוא בדרך כלל לעשות כדיבעיות עם המפתח או Fixer, או הסרט נחשף באופן חלקי, 2) על רקע שקופיות הזכוכית היא בדרך כלל עקב בעיות עם הכנת כביסה או זכוכית השקופית, כגון silination לא נכון של השקופיות ממקור מסחרי או עצמי מוכן, 3) אמולסיה חשיפה רקע בפיתוח, ו 4) על רקע סעיף או בשל חוסר שלאחר הכלאה בצעדים זהירים כביסה, טמפרטורה נמוכה מדי של הכלאה, איכות ירודה של פתרון ההכלאה, זיהום paraformaldehyde במנות כביסה גורמת באופן קבוע בדיקות צולבות הקישור כדי השפלה, riboprobe רקמות המוביל מולקולות קטנות תיוג רקמות לא באופן ספציפי, DTT פעיל או β-mercaptoethanol וכתוצאה מכך צלב החיבור של S 35-רנ"א בדיקות ב-di גופרי אג"ח לרקמות, ומחכים זמן רב מדי עבור acetylation. זה קריטי כדי לקבל את השקופיות פתרון acetylation בתוך שניות של ערבוב אנהידריד בכאבים ודלקות שאינן זיהומיות אצטית. אם מספר דקות לעבור withouלא הוספת הפתרון השקופיות, ולאחר מכן קבוצות אצטיל לא יוסרו באופן יעיל ואז לאגד RNA שאינן במיוחד. גורמים אחרים כוללים הכלאה על 20 שעות, מה שעשוי ליצור חזקה מדי של האות, ואת טיפות שמן עודף בשקופיות, אשר הטמנת פתרון הכלאה על השקופיות במהלך שוטף מימית, וכתוצאה מכך נקודות רדיואקטיביים על רקמת ומחליק נותן אותות רקע כהה. אם עובדים עם שקופיות רבות (יותר מ -100 פרוסות), להוסיף 3 rd כלורופורם לשטוף או לשנות שוטף כלורופורם, כדי למנוע חלקיקים מן עודפי השמן הנותר על השקופיות. טיפול רקמות רשלנית, כלומר לא קופאים מהר מספיק (תוך 5-10 דקות לאחר דיסקציה) או הפשרת מחדש הקפאת גם מעלה הרקע בשל mRNA השפלה. להיזהר שלא לטעות רקע החשיפה נגמר.

על רקע תחליב בשקופיות טבל אפשרי כי זה קל מאוד רגיש ודורש חשיפה ארוכת בחושך. Com בעיות דוד, כולל רקע גבוה מדי של הטמפרטורה על היזם ו Fixer. כאשר הטמפרטורה עולה על 19 מעלות צלזיוס, קרוב או חם יותר מאשר בטמפרטורת החדר, יותר רקע גרגר כסף מתקבל. חשיפה לרמות נמוכות של אור דולף אל תוך החושך יגרום רקע אמולסיה. לא לשטוף את Fixer מספיק זמן (לפחות 30 דקות במים זורמים), יעזוב מסדר את זה אז מגיב עם סגולה cresyl ליצור משקע חום לאורך כל אמולסיה. עם זאת, אם את השקופיות נשטפים במים זמן רב יותר מאשר 90 דקות לאחר קיבוע לפני צביעת סגול cresyl, זה יכול לגרום תחליב להיות רפוי בסעיפים להכתים גרוע. אם אין מספיק זמן כדי להכתים את שקופיות בתוך חלון 30-90 דקות לאחר קיבוע כביסה, לשטוף לאחר 30 דקות, לייבש את השקופיות לילה ולהמשיך עם סגול cresyl מכתים למחרת. באופן כללי, רוב mRNAs יש דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, ואילו האות רקע אחיד יותר.

e_content "> דק מקופל יכול להטעות לתוצאות ביטוי גנים על הסרט X-ray, מה שמוביל לאזור עם אות כהה יותר. כדי לקבוע אם הרקמה מקופל, לבחון שאינו מוכתם סעיפים תחת darkfield או חלקים סגולים cresyl צבעונית תחת brightfield. Cresyl counterstaining סגול מספק דרך טובה יותר לבחון את מצב הרקמות.

לפרשנות טובה יותר של סגוליות הבדיקה, תחושת שליטה בדיקות צריך להיות מיושם על חלקים סמוכים. בדיקות תחושת ביותר לא מראים אות, אבל יש כאלה, וכשהם עושים זאת, אנו מוצאים כי לעתים קרובות שונה מאשר אות antisense. אנו מאמינים כי זה יכול להיות קשור antisense סינתזה או אחרת הגן על גדיל antisense של הגנום. אנו מציגים דוגמה Pax6 היגיון בדיקות antisense (איור 2 א 'וב'). הגדיל antisense מגלה תיוג לאורך אזור חדרי המוח הקטן של המוח הקדמי, ואת העין כצפוי (איור 2 א), אבל במובן מגלה להbeling בשכבת הפיגמנט של הרשתית (איור 2 ב).

עבור גדלים בדיקה, אנו משתמשים בדיקות cDNA במקום כלשהו בטווח של 300-5000 BPS. בדיקות פחות מ 300 bps עבודה, אבל את האותות הם בדרך כלל חלשים. לא ניסינו חלליות גדולות יותר מ 5000 bps. עדיף להשתמש בדיקות על רקמה אותו מין אם הדבר אפשרי. אם לא, אנחנו צולבות להכליא בדיקות על קטעים של מינים אחרים, להקטין את ההכלאה ולשטוף הטמפרטורות ב 3-5 מעלות צלזיוס במרווחים המבוססים על זהות ברצף, אם הוא ידוע. אם לא ידוע, אז אנחנו מבצעים הכלאה של ניסוי וטעייה ולשטוף בטמפרטורות. אם הטמפרטורה יורדת יותר מדי, החללית cDNA יכול לעבור, להכליא עם mRNAs אחרים של רצפים דומים ברחבי המינים או מאותו המין 11. בפועל, אנו מוצאים כי cDNAs כי הם ~ 95% או יותר זהה ליעד mRNA ברקמה, הכלאה מחמירים טמפרטורת הכביסה (65 ° C) תנאים עובד היטב. עבור רצפים הנמצאים צלצלES של ~ 85-94% זהה, הכלאה וטמפרטורה לשטוף ייתכן שיהיה צורך להפחית בטווח של ~ 50 עד 60 ° C.

הסיבה לשימוש מתקן מתכת ביותר המדרגות הוא שימוש שוטף כלורופורם קסילן. ממיסים אורגניים שני סוגים רבים של פלסטיק. זכוכית וכמה סוגים של פלסטיק עמידים אלה חומרים אורגניים. אבל זכוכית היא יותר קל לשבור, וכמה פלסטיקים שבהתחלה הם עמידים יתמוססו על תקופות ארוכות של חשיפה של חומרים אורגניים.

איור 1
באיור 1. Autoradiography של in-situ הכלאה של תמונות רנטגן סרטים ושקופיות תחליב טבל. (AB) X-Ray הסרט תמונות של sagittal חלקים כל הראש של פינק זברה ציפור שיר ביום עוברי 10, הכלאה עם riboprobes antisense ל (A) FoxP1 או (ב) CoupTF2, נלקח עם תאורה brightfield תחת מיקרוסקופ לנתח. שחורים, גרגרי שנחשפו בסרט מראה mRNA אקספרסיון. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (CD) אמולסיה טבל שקופיות של sagittal חלקים כל הראש של פינק זברה ביום האץ' הודעה 6, הכלאה עם riboprobes antisense עד (ג) FoxP1 (ד) CoupTF2, נלקח עם תאורה darkfield תחת מיקרוסקופ לנתיחה. לבן, חשוף דגנים כסף ב תחליב מעל רקמת מראה ביטוי ה-mRNA. סגול אדום, cresyl הכתם. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. עבור כל תמונה, המקור הוא מקורי שמאלה. הרנטגן תמונות הסרט נחשפו במשך יום אחד, שקופיות טבל במשך 3 ימים. בדיקה FoxP1 הוא 178 bps לחלק BP 1544-1711 של ה-mRNA, CoupTF2 הוא 545 bps לחלק נ"ב 1-545 של ה-mRNA. כפי שניתן לראות, בתוך ה-mRNA FoxP1 המוח הקדמי הוא מועשר ב mesopallium (M), הסטריאטום (א ') ו התלמוס הגבי (DT), ואילו CoupTF2 מועשרת ב nidopallium (N), arcopallium (א), התלמוס הגחוני יותר . יש עקביות ביטוי בין סוגים חשיפה (ו הגילאים). עם שקופיות טבל, לעומת זאת, תיוג רזולוציה גבוהה יותר נראה,גבולות רקמה ד ואזורי מזוהים באופן ישיר. אלה וכל תמונות אחרות המוצגות במאמר הן מן החלקים באמצעות תקן 65 ° C הכלאה חומרה גבוהה.

איור 2
איור 2. השוואת antisense וסימון תחושה מראה דפוסים שונים. (א) הגדיל antisense של Pax6 באה לידי ביטוי במוח, במיוחד באזור חדרית (חץ לבן). הוא הראה autoradiography על x-ray סרטים של sagittal פרוסות כל הראש שנלקחו זברה פינק ביום עוברי 12. (ב) סעיף צמוד הכלאה עם גדיל את תחושת Pax6 מגלה שום ביטוי ברקע לאורך כל הראש עובר, אבל ביטוי ברור של שכבת הפיגמנט של הרשתית (חיצים שחורים) כאפיק antisense. קו מקווקו מציין את קווי המתאר של המוח כולו. C: המוח הקטן.

איור 3
rong> באיור 3. ב אותות באתרו של ביטוי גנים שקופיות תחליב טבל שנלקחו המוח פינק זברה בשלבים עובריים בסוף שנות תחת צפיות brightfield ו darkfield. (א) brightfield התמונה הביטוי D1B ביום עוברי 10 מחשיפה נורמלי אמולסיה. תווית (שחור) בקושי אפשר לראות בהגדלה זו. החללית הוא 625 bps לחלק נ"ב 1-625 של ה-mRNA. (ב) סעיף ההגדלה זהה כמו () אבל עבר נוף darkfield מראה התווית (לבן) בסטריאטום (א ') ו התלמוס (ה'). (ג) brightfield התמונה הביטוי Slit3 ב 12 יום עובריים מחשיפה אל אמולסיה. לייבל (שחור) יכול בקלות לראות. החללית הוא 779 bps לחלק 1243-2021 של ה-mRNA. (ב) סעיף ההגדלה זהה כמו (א) עבר תווית צפה darkfield מראה (לבן) בחוט השדרה (SC) התואמת את התמונה brightfield. מקורי מכוונת שמאלה. CB: המוח הקטן.

/ 3764/3764fig4.jpg "alt =" איור 4 "/>
איור 4. ברזולוציה כסף תבואה ברמה התאית. הוא הראה FoxP1 תווית ה-mRNA של פינק זברה המוח הקדמי עם גרגרי כסף (כתמים שחורים) מעל תאים (סגול cresyl) באזורי המוח בגילאים שונים לעומת תמונות חשמל נמוכה יותר של איור 1 א ו 1 ג. () שפע ביטוי גבוהה על תאים בודדים (חיצים שחורים) ב הבוגרת זברה פינק mesopallium. (ב) שפע ביטוי נמוך מעל תאים בודדים (ראשי חץ שחור) nidopallium צמוד של אותו סעיף. (C) גבוהה FoxP1 mRNA ביטוי על תאים (חיצים שחורים) ב mesopallium עובריים יום 12. (ד) לרב ביטוי נמוך מעל תאים (ראשי חץ שחור) nidopallium צמוד של אותו סעיף. תאים למשל הם חגו עם קו צהוב. תאים עובריים (C ו-D) הם קטנים ארז חזק יותר לעומת תאים בוגרים (A ו-B). מאז יש קצת מקום בין תאים תחליב, שטח הפנים של Si נחשףדגנים lver מן החללית S 35 הם גדולים מעט יותר מהאזור של גופי התא. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.

Discussion

רדיואקטיבי הכלאה באתרו של ביטוי mRNA נעשה שימוש נרחב למטרות מרובות, כולל ללימוד הארגון רקמות אזורי, סוגי תאים, ואת הפעילות המוחית התפקודית 2-5,10,12-14. שימוש אחר הוא על גנים, אשר הביטוי mRNA במוח תלויה פעילות עצבית מוגברת, המכונה לעתים קרובות פעילות תלויי גנים או גנים מוקדמים מיידיות. עם השימושים האלה, השיטה שלנו יושם על פני מספר רב של מינים, כולל ציפורים, יונקים (למשל אדם), דגים, דו חיים, ברקמות רבות, כולל המוח, העור, השרירים, והגילאים מרובות, כולל גוזלים / תינוקות, ונוער , מבוגרים, והנה העובר בחלקים שלמים 2,3,5,15-17. התכונות המיוחדות של פרוטוקול שלנו כוללים: (1) הוא מייצר איזון בין ייחוד אנטומי וספציפיות כמותית. כדי לכמת את ביטוי הגנים על הסרט X-Ray, אנחנו לוקחים את התמונות הדיגיטליות של התמונות (לשעבר:. איור 1A ו-1B), השתמש Photoshop (Adobe) היסטוגרמה פונקציה כדי למדוד את צפיפות פיקסלים באזורים בעלי עניין ולחסר את רמות הרקע על הסרט מחוץ רקמות אך עדיין בשקופית זכוכית 2,4. לכמת ביטוי ברמה התאית, אנחנו לוקחים תמונות של גרגרי כסף על תאים בהגדלה גבוהה (40-100x, איור 4). לאחר מכן, אנו משתמשים סף פונקציות מידה של J תמונה של וויין Rasband ב-NIH על מנת לספור את מספר גרגרי כסף בתמונה, להפחית את מספר רקע בתחום דומה ללא תאים בשקופית זכוכית, לחלק במספר תאים, להשיג כמה ערכים של ביטוי לכל תא. 4,18 (2) ניתן תפוקה גבוהה יחסית, מה שמאפשר עיבוד של 100-200 שקופיות בו זמנית, עקב חותם coverslip חזק שנוצר על ידי אמבט שמן מינרלי. סטנדרט in-situ שיטות הכלאה להימשך זמן רב יותר לסגור את השקופיות עם parafilm, לק, ואמצעים אחרים, בהם שקופיות תופסים הרבה מקום, (3) זה מאודרגיש תמלילי שפע נמוכה עקב סולפט dextran פתרון של Denhardt במאגר הכלאה 2,13, (4) הגישה הדמיה darkfield מניב תמונות עם ניגודיות גבוהה בשל מצלם תחת תאורה darkfield על מיקרוסקופ לנתח 4,5. בנוסף, היא מאפשרת זיהוי הרגיש של שינויים קטנים ביטוי גנים, כמו בביטוי תלוי בפעילות הגן לזהות אזורים במוח ספציפיים המופעלים בזמן התפיסה והייצור של התנהגויות ספציפיות 19. המגבלות ביחס שאינם רדיואקטיביים פרוטוקולים הן כי האחרונים הם ברורים בהחלטה הסלולר ואת המיקום של ה-mRNA בתוך התא, ועבודה עם אמולסיה רגישה מאוד מניפולציה ואור. ניתן לשלב את השיטה שלנו עם שיטות אחרות, כגון אי - רדיואקטיבי הכלאה באתרו לתייג ביטוי mRNA של גן אחד או יותר בתוך הרקמה באותו 10,17,20. זה יכול להיות משולב עם immunocytochemistryלתייג את שתי רנ"א ביטוי החלבון על מדגם זהה כדי שיתוף לתהליך הלוקליזציה של mRNA עם סוגי תאים מסוימים 10. השינויים בפרוטוקול הדרושים כאלה ניסויים תיוג כפולים מתוארים והאסמכתאות.

לסיכום, הגישה שלנו מאפשרת הבנה של תזמון ומיקום הסלולרי של ביטוי גנים לשם הבנת הארגון באזור, פעילות רקמה תפקודית, ותפקוד הגן.

Disclosures

אין לנו מה למסור.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לכל חברי המעבדה ג'רוויס מי שיפר את הפרוטוקול במהלך השנים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride VWR MK242002
Chloroform VWR BDH1109
Cresyl violet acetate Sigma C5042
Cryostat Thermo scientific Microm HM550
Deionized formamide Sigma F9037
DTT Promega P1171 100mM
EDTA Sigma ED
Embedding mold VWR 15160-215
Fisher brand Superfrost plus slide Fisher Scientific 22-034-979
Formaldehyde VWR BDH0506-4LP
Formamide Sigma F7508
GENECLEAN kit Q-Bio gene 1001-200
Kodak BioMax MR film Sigma Z350370
Kodak NTB Emulsion Carestream Health 8895666
Kodak Professional developer D19 Kodak 1462593
Kodak professional Fixer Kodak 1971746
β-mercapt–thanol Calbiochem 444203
Mineral oil VWR IC15169491
NaOH VWR SX0600-1
Paraformaldehyde Sigma 76240
Poly A Invitrogen POLYA.GF
rATP Promega P1132 10mM
rCTP Promega P1142 10mM
rGTP Promega P1152 10mM
RNasin Promega N2111 40Units/μl
S35 UTP PerkinElmer NEG039C001MC
Safety-Solve solution Safety Solve Research Products International 111177
Sodium Acetate Sigma S7899 3M
Sodium phosphate dibasic Sigma S3264
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
SP6 RNA polymerase Promega P1085
Staining metal rack Electron Microscopy Sciences 70312-54
T7 RNA polymerase Promega P2075
Tissue-Tek OCT Sakura 4583
5x Transcription buffer Promega P1181
Triethanolamine VWR IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) VWR 101449-446
tRNA Roche 10109509001

Solutions:
  1. Reagents for making of riboprobes: 1.5 μl DNA template (0.2-0.3 μg/μl), 2 μl of 5x optimized transcription buffer, 1 μl of 100mM DTT (comes with Polymerase from Promega, mix well at room temperature), 0.3 μl of RNasin (40 units/μl), 1.5 μl of AGC ribonucleotide mix solution, 3.5 μl of S35 UTP, and 1 μl RNA polymerase. Bring up to 10 μl with nuclease-free water.
  2. AGC ribonucleotide mix solution: mix equal amounts of 10mM ATP, GTP and CTP together.
  3. Sodium acetate solution for EtOH precipitation to remove free S35 UTP: 40 μl RNase and DNase free water, 5 μl of 3M Sodium Acetate, and 125 μl of 100% EtOH.
  4. Hybridization buffer (10ml stock): 5 ml of 100% deionized formamide, 600 μl of 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8.0), 240 μl of 0.5M EDTA (pH =8.0), 100 μl of 100x Denhart's solution, 100 μl of 1M DTT, 250 μl of 20mg/ml tRNA, 125 μl of 20 mg/ml poly A, and 1 g of Sodium Dextran Sulfate. Add DEPC-treated water to bring the total volume to 10 ml. Shake vigorously and then incubate at 55 °C until all sodium dextran sulfate is dissolved. Store the hybridization buffer in -20 °C, which is good for ~6 months.
  5. 4% buffered paraformaldehyde solution: Add 40 g of paraformaldehyde in 760 ml distilled water in a flask designated for paraformaldehyde, heat to 50 °C on a hot plate while stirring. Add 320 μl of 10N NaOH to help dissolve the paraformaldehyde. After dissolving (~10 min), add 100 ml of 10x PBS, and bring the volume up with distilled water until 1 liter. Stir and heat the solution until paraformaldehyde is dissolved. The pH should be 7.4.
  6. Acetylation buffer: 13.6 ml of triethanolamine plus 2.52 ml of acetic anhydride in 1 liter of distilled water.
  7. 20x SSPE solution: 3M NaCl, 200 mM NaH2PO4-H2O, and 200 mM EDTA in distilled water. Adjust solution to pH 7.4 with 10N NaOH.
  8. 10x PBS buffer: 80g of NaCl, 2.0g of KCl, 14.4g of Na2HPO4, and 2.4g of KH2PO4 in distilled water. Adjust solution to pH 7.0 and bring total volume to 1 liter.
  9. Second wash solution: 0.1% β-mercapt–thanol and 50% formamide in 2x SSPE
  10. Cresyl violet acetate solution: 3% cresyl violet acetate in tap water (distilled water prevents good staining), dissolved overnight with stirring in a flask at room temperature. Filter with vacuum suction through a 1mm Whatman filter paper and Buchner funnel.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
  2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
  3. Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  4. Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
  5. Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
  6. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
  7. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  8. Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
  9. Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
  10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
  11. Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
  12. Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
  13. Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
  14. Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  15. Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
  16. Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363 (2005).
  17. Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
  18. Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
  19. Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768 (2008).
  20. Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).

Tags

מדעי המוח גיליון 62, רדיואקטיבי riboprobes חוליות העובר כסף אמולסיה darkfield גנטיקה
רדיואקטיבי<em> באתרו</em> הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. … More

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. J. Vis. Exp. (62), e3764, doi:10.3791/3764 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter