Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Radioaktivt In situ Hybridisering för Upptäcka Diverse Mönster genuttryck i Tissue

Published: April 27, 2012 doi: 10.3791/3764
Automatic Translation
1, 2, 1
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University, 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

Summary

Detta protokoll används framgångsrikt för att kvantitativt påvisa nivåer och rumsliga mönster av mRNA-expression i flera vävnadstyper över ryggradsdjur. Metoden kan detektera låga förekomst avskrifter och tillåter bearbetning av hundratals bilder samtidigt. Vi presenterar detta protokoll att använda expression profiling av aviär embryonal hjärn-bildningen som ett exempel.

Abstract

Att känna till den tidpunkt, nivå, cellulär lokalisering och celltyp som en genen uttrycks i bidrar till förståelsen av funktionen av genen. Var och en av dessa funktioner kan åstadkommas med in situ-hybridisering till mRNA i celler. Här presenterar vi ett radioaktivt in situ hybridisering metod modifierad från Clayton et al. (1988) 1, som har arbetat framgångsrikt i vårt labb i många år, särskilt för vuxna ryggradsdjur hjärnor 2-5. De långa komplementära RNA (cRNA) prober till målsekvensen medger detektering av låga förekomst transkript 6,7. Införlivande av radioaktiva nukleotider i de cRNA-prober medger ytterligare detektionskänslighet av låg förekomst transkript och kvantitativa analyser, antingen genom ljuskänslig röntgenfilm eller emulsion belagda över vävnaden. Dessa detektionsmetoder tillhandahålla en långsiktig register av målgenuttryck. Jämfört med icke-radioaktiv prob methODS, såsom DIG-märkning, kräver den radioaktiva proben hybridiseringsmetoden inte flera förstärkningssteg med användning av HRP-antikroppar och / eller TSA kit för att detektera låga förekomst transkript. Därför tillhandahåller denna metod en linjär relation mellan signalintensitet och riktade mängder mRNA för kvantitativ analys. Det gör att behandla 100-200 bilder samtidigt. Det fungerar bra för olika utvecklingsstadier av embryon. De flesta utvecklingsstudier av genuttryck använda hela embryon och icke-radioaktiva metoder 8,9, delvis på grund av embryonal vävnad är bräckligare än vuxen vävnad, med mindre sammanhållning mellan celler, vilket gör det svårt att se gränserna mellan cellpopulationer med vävnadssnitt. Däremot är vårt radioaktivt sätt, på grund av större utbud av känslighet, möjlighet att få högre kontrast i resolution av genuttryck mellan vävnad regioner, vilket gör det lättare att se gränser mellan populationer. Med denna metod kan forskare avslöjaeventuella betydelsen av en nyligen identifierad gen, och vidare förutsäga funktionen hos genen av intresse.

Protocol

1. Vävnadsberedning

  1. Harvest nya vävnader. För fågelembryon, öppna försiktigt ägg och rengör embryo i en skål med 1 x PBS, två gånger. För vuxna hjärnan, snabbt avlägsna hjärnan och försiktigt tvätta med 1 x PBS.
  2. Bädda in embryon eller vuxna hjärnan in i en inbäddad form full av oktober vävnad tek, orientera vävnaden som behövs för sektionering och snabbt frysa blocket genom att placera den i en etanol och torris blandningen, är noga med att inte få blandningen insidan av blocket .
  3. Skiva den frysta provet i en kryostat till 10-12 nm tjocka sektioner. För hjärna och embryonal vävnad, är den bästa skärande tempererade inom intervallet -18 ° C till -20 ° C.
  4. Montera frysta snitt om Super plus glasskivor.
  5. Förvara avsnitt i en bild box vid -80 ° C.

2. Generering av radioaktiva Riboprober (Använd förfaranden strålsäkerheten hos din institution)

  1. Skapa en renad linjär DNEn mall av en cDNA av intresse, antingen genom enzymet begränsad digerering av ett klonat fragment omgivet av RNA polymeras-promotor från en plasmid-DNA eller genom PCR av insatsen fäst till de RNA-bindande polymeraspromotor ställen. Det är också möjligt att generera PCR-fragment med de RNA-polymeraspromotorer såsom en del av 3 'och 5' PCR-primrar. Geler rena dina begränsade eller PCR-fragment med GENECLEAN gelrening kit.
  2. Att en 0,5 ml Eppendorf-rör, tillsätt 0,5-1 | ig renat linjär DNA-mall, transkription-buffert, DTT, RNasin, AGC nukleotidblandning lösning och RNas-fritt vatten för att bringa volymen upp till den önskade mängden. Tillsätt sedan S 35-UTP och lämplig RNA-polymeras för att göra antingen antisense-eller förnuft riboprober.
  3. Inkubera blandningen under 1 h i en 37 ° C vattenbad. Lägga till en annan alikvot av RNA-polymeras och inkubera under ytterligare 1 timme.
  4. Tillsätt 3M natriumacetatlösning (0,1-faldig total volym) och 100% EtOH (2,5 fold av totala volymen) i Eppendorf-rör för att fälla ut den syntetiserade RNA riboprob.
  5. Inkubera i torr is eller -80 ° C under 15 min eller mer än 3 timmar för att hjälpa utfällning.
  6. Pelleten RNA genom centrifugering vid 4 ° C och 15.000 varv per minut i en bordsskiva Eppendorf-centrifug i 30 min.
  7. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 70% EtOH trycker med fingret för att blanda pelleten väl.
  8. Pelleten åter-RNA genom centrifugering vid 4 ° C och 15000 rpm under 30 minuter.
  9. Avlägsna supernatanten helt genom pipettering och sedan lägga 40 fil hybridiseringslösning. Blanda väl genom pipettering in och ut.
  10. Sätt 1 il av lösningen i 3 ml Safety-Lös lösning i scintillationskärl, blanda väl, och mäta de räknas i scintillationsräknare.
  11. Placera en Eppendorf med riboprob vid -20 ° C för användning inom en vecka.

3. Vävnad Behandling

  1. I en huva, bered nya PBS buffrad 4% paraformaldehyde lösningen till ca 3-5 ° C över rumstemperatur. Placera objektglasen från -80 ° C lagring i en metall kuggstång på torris, bära med arbetsutrymme under huven, och sedan placera stället i 4% paraformaldehyd-lösning och inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
  2. Tvätta 3 gånger i 1 x PBS ca 15 doppningar vardera (omkring 1 sekund per doppning).
  3. I huven, gör acetylering buffert och skaka den kraftigt inom 10 sekunder. Omedelbart häll en bricka som innehåller rack av bilder och inkubera under 10 minuter, för att minska bakgrund bindning av riboprob.
  4. Skölj 3 gånger i 2 x SSPE under 15 doppningar.
  5. Torka i 70%, 95% och 100% EtOH seriell under 2 min i varje steg (behöver inte vara i huven).
  6. Torka objektglasen under huven i minst 10-15 min.

4. Hybridisering

  1. Beräkna mängden riboprob (0,5-1x10 6 cpm per bild) och hybridisering lösning (100 pl per bild) som behövs för alla bilder. Prewarm den riboprob-hybridiseringsblandning till 65 ° C under 5 min för att denaturera riboprob.
  2. Pipettera 100 pl riboprob-hybridisering lösning i en linje över bilden och använd ett täckglas för att sprida den jämnt över vävnaden och täckglaset. Placera objektglasen horisontellt riktad uppåt till en metall rack och plats rack långsamt upprätt i 65 ° C oljebad i minst 4 timmar och högst 16 timmar. Oljan skapar en lufttät tätning runt täckglasen.
  3. Ta bort metall hyllor från oljebadet och torka av överflödig olja runt rack med läskpapper.
  4. Tvätta olja från de berörda bilderna och metall rack i glas eller metall brickor som innehåller kloroform, två gånger. Den 2: a tvätt kloroform kan användas som den första för nästa experiment.
  5. Överför rack med täckta glider in en bricka med i 0,1% β-merkaptoetanol + 2 x SSPE lösning och rör sig upp och ner för några dips för att lossa täckglas och avlägsna lösa överskottet hybridisering lösningartion.
  6. Överför rack med täckta bilder i färsk lösning av 0,1% β-merkaptoetanol + 2 x SSPE, och ta sedan bort täckglas med en RNas gratis pincett i lösning för att undvika repor vävnadssnitt. Överföra de otäckta glider in frisk kuggstång i en bricka horisontell slid säteshållaren, i en lösning av 0,1% β-merkaptoetanol i 2 x SSPE.
  7. Inkubera kuggstången med bilder i färskt 0,1% β-merkaptoetanol + 2 x SSPE-lösning vid rumstemperatur under 1 h för att avlägsna överskott av obunden RNA-sond. Kassera denna och de tidigare vattenhaltiga tvättlösningarna, såväl som täckglas som radioaktivt avfall.
  8. Överföra kuggstången med objektglas till ett förvärmt 2x SSPE-lösning vid 65 ° C, tillsätt β-merkaptoetanol till en slutlig 0,1% koncentration, och inkubera vid 65 ° C under 1 timme. Kasta som radioaktivt avfall.
  9. Överföra och inkubera rack med bilder två gånger i förvärmt 0,1 x SPPE vid 65 ° C i 30 minuter vardera. Den mängd radioaktivitet avlägsnades idetta steg är mycket liten och inte längre betraktas som alltför radioaktivt avfall efter detta steg.
  10. Dehydratisera kuggstången och glider i 70%, 95% och 100% EtOH under 2 min vardera.
  11. Torka objektglasen i huven för minst 30 min.

5. Visualisering av radioaktivt Signal

  1. Placera torra bilder till en film kassett och i ett mörkt rum, placera x-ray film (Kodak BioMax MR-film) över bilderna och stäng kassetten. Kontrollera att de glider är vända emulsionen sidan av röntgenfilm. Exponera bilder under cirka 1-7 dagar beroende på förväntad förekomst av avskrifter.
  2. Utveckla x-ray film i vanlig utvecklare och fixare. Hybridiseringssignalen visas som svarta (exponerade silverkorn i emulsionen) på filmen (fig 1).
    1. (Valfritt) För att avgöra cellulär upplösning och se signal på vävnaden, bilderna måste doppas i fotografisk emulsion och motfärgades.Om du ska så småningom Motfärga med kresylviolett, sedan delipidize sektioner genom inkubering i xylen under 5 minuter vid rumstemperatur två gånger, rehydrera vardera 1 min i 100%, 100%, 95%, 95%, 70% och 50% EtOH och sedan i avjoniserat vatten. Om du inte kommer att färga med ett färgämne som inte kräver delipidization, då delipidization är inte nödvändigt. Torra bilder väl under en huva i minst 2-3 timmar.
    2. I det mörka rummet med ett säkert ljus, ösa ut tillräckligt Kodak NTB emulsion för att täcka halva bilden längden (dvs. vävnad) i glas doppa behållare och sedan smälta i en 42 ° C vattenbad under 20-30 min. Sedan späda ut den med destillerat vatten till ett förhållande av 1:1. Nivån av emulsionen ska nu omfatta alla delar i en bild när bilden doppas i den. Om du har en massa bilder, kan du behöva förbereda extra emulsion.
  4. Dip glider in i utspädda emulsionen i 42 ° C vattenbad och torra doppade glider i en sluten ljus tät behållare overnigHT i det mörka rummet, eller i en ugn vid 37 ° C under 2-3 timmar, med lamporna.
  5. Överför bilderna i rack spår i svarta lådor som innehåller exsickatorer, var försiktig för bilderna inte berör varandra och därmed skapa artefakter. Täta kanterna på lådorna med svart eltejp långsamt för att förhindra statisk-inducerade ljus gnistor och sedan svepa rutorna i aluminiumfolie. Lagra rutorna vid 4 ° C från flera dagar till veckor (signal från 1 dag på röntgenfilm liknar 5 dagar under emulsion).
  6. Värma de glider rutorna till rumstemperatur under 1 timme.
  7. I mörkrummet bort rack med bilder (eller den plats bilder i en metall rack om du använder lådor med bildspel slots) från lådorna och utveckla dem i Kodak D-19 utvecklaren på 16 ° C under 3,5 minuter.
  8. Tvätta de utvecklade objektglasen i kranvatten vid rumstemperatur under 1 min.
  9. Inkubera objektglasen två gånger i fixer vid 19 ° C under 6 min vardera. Belysning kan slås på under det andra fixer inkubation. Tvätta glasen i rinnande vatten i rumstemperatur i minst 30 minuter och skrapa emulsionen från baksidan av bilden, medan "våta" med ett rakblad för att undvika repor på glaset.
  10. Fläcka vävnad med 0,3% kresylviolett i kranvatten under 5 minuter.
  11. Tvätta extra kresylviolett lösning i färskt kranvatten för ~ 15 dips.
  12. Torka objektglasen för ~ 15 dips i varje alkohollösning: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% och 100% EtOH.
  13. Inkubera objektglasen i xylen under 5 min vid rumstemperatur två gånger.
  14. Täckglaset med Permount medium på bilden och torka den täckta bilden i huven över natten (> 16 timmar), det kommer att ta flera dagar innan limmet är robust nog att rengöra bilderna ytterligare.

6. Generera Darkfield färgbilder

  1. Om det behövs ytterligare rena överskottet emulsion på baksidan av bilderna (icke-coversliped sida utan vävnad) genom att blöta den med vatten och skrapa med ett rakblad.
    2. <li> Skölj objektglasen med 80% EtOH-lösning och torka 1-2 gånger försiktigt för att bli av med skräp och damm.
  2. Ta bilder under mörkfält eller brightfield belysning. Steg 6.2 och 6,3 kan behöva upprepas 2-3 gånger för att erhålla en bra bilder utan dammpartiklar, som lätt ses i mörkfält under ett dissektionsmikroskop.

7. Representativa resultat

Det finns två huvudsakliga sätt att se på in situ hybridisering resultat på vävnadssnitt hybridiserade med S 35 radioaktiva sönder: 1) x-ray film som placerades över bilderna eller 2) emulsion som belagts på bilderna. Ett tredje sätt är att använda en Phosphorlmager skärm som placeras över bilderna, men vi har inte varit nöjda med att lösa detta tillvägagångssätt. X-ray filmer ger ett snabbt resultat och analyser av det allmänna tillståndet för hybridisering. X-ray film data avslöjar också en bred anatomiska upplösning och kan användas för kvantitativa analysär 10. Exempel på röntgenfilm bilder av sena fågelembryo huvuden hybridiserade med antisens-prober för FoxP1 och CoupTF2 genexpression är i figurerna 1A och B. Båda generna förekommer rikligt i specifika delar av hjärnan underavdelningar. En god kvalitet röntgenfilm Resultatet bör bli högre (inte suddig) och har högt signal-till-bakgrund-förhållande. En suddig bild kan bero på ojämn kontakt mellan en röntgenfilm och glasskiva med den hybridiserade vävnaden.

För emulsionsfärger doppade glider innehåller emulsionen ljuskänsliga silversalter belagda på den vävnad som apposed att vara på plast av röntgenfilm. Vid framkallningen, S 35, som är utsatta silversalter omvandlas till metalliskt silver korn, ungefär som i röntgenfilm. Men silver insättningar är direkt synliga över de celler som representerar genuttryck som kan observeras och mätas kvalitativt under ett mikroskop. De metalliska silverkorn blockerar direkt ljus genomoch visas som svarta prickar under brightfield vy. Den kresylviolett motfärg visas i violett (fig. 3A, 3C och fig 4). I mörkfält de silverkorn reflektera ljus som kommer från sidan och visas som vita prickar (Fig. 1C, 1D, 3B och 3D). I denna situation verkar kresylviolett färgas röd färg. I ljusfält, är hybridiseringssignalen lättare att se under hög förstoring vid cellulär upplösning, medan den i mörkfält, dessutom kan hybridiseringssignalen betraktas under lägre förstoring över hela vävnaden. Den mörkfält Utsikten är den strategi som vi vanligtvis använder för att visa övergripande mönstret genuttryck. Men i förhållande till den snabba resultatet från X-ray filmer, tar emulsionen doppade bilderna längre tid (en till flera veckor) och är mer känslig för att få bakgrunden.

Det finns fyra vanliga källor till stark bakgrund: 1) Bakgrund hela x-ray film brukar göra för attproblem med utvecklare eller fixare, eller delvis exponerade filmen, 2) Bakgrund till objektglas är oftast på grund av problem med tvätt eller glas preparatet, såsom felaktig silination av bilderna från kommersiell källa eller egen förberedd, 3) emulsion exponering och utveckling bakgrund, och 4) Bakgrund avsnittet antingen på grund av brist på noggranna efter hybridisering tvättsteg, alltför låg hybridiseringstemperatur, dålig kvalitet på hybridiseringslösningen, paraformaldehyd föroreningar i diska orsaka sonder för att varaktigt över-link till vävnaden, riboprob nedbrytning vilket leder till små molekyler märkning vävnad ospecifikt, inaktiva DTT eller β-merkaptoetanol resulterar i tvärbindning av S 35-RNA-prober i di-sulfid obligationer till vävnaden, och väntar för länge för acetylering. Det är viktigt att ha bilderna i acetylering lösning inom några sekunder efter blandning av ättiksyraanhydrid och trietanolamin. Om några minuter passerar without lägga lösningen på bilderna, då acetylgrupper inte kommer att effektivt bort och sedan binda till RNA-ospecifikt. Andra faktorer inkluderar hybridisering över 20 h, vilket kan generera för stark av en signal, och överskott droppar olja på bilderna, som isolerar hybridiseringslösningen på bilderna under vattenbaserade tvättar, vilket resulterar i radioaktiva fläckar på vävnaden och glider ge mörk bakgrund signaler. Om man arbetar med många bilder (mer än 100 skivor), lägg till en 3: e kloroform tvätta eller ändra kloroform tvättar att förhindra alltför stora oljepartiklar från kvar på bilderna. Careless vävnad behandling, dvs inte frysa tillräckligt snabbt (inom 5-10 minuter efter dissektion) eller upptining och återfrysning ökar också bakgrunden på grund av mRNA nedbrytning. Var noga med att inte förväxla bakgrund till över exponeringen.

För emulsion bakgrund på doppade bilderna är möjlig eftersom den är mycket ljuskänslig och kräver lång exponering i mörker. Com mon bakgrund problem är alltför hög temperatur för utvecklare och fixare. När temperaturen är högre än 19 ° C, nära eller varmare än rumstemperatur, är mer silver korn bakgrund erhölls. Exponering för låga nivåer av ljus läcker in ett mörkrum kommer att orsaka emulsion bakgrund. Inte uttvättning fixer tillräckligt lång (åtminstone 30 minuter i rinnande vatten), kommer att lämna fixer som sedan reagerar med kresylviolett för att generera en brunaktig fällning hela emulsionen. Men om bilderna tvättas i vatten längre än 90 minuter efter fixering före kresylviolett färgning, kan detta leda till att emulsionen blir lösa och sektionerna för att färga dåligt. Om det inte finns tillräckligt med tid för att färga objektglasen i en 30-90 minuter fönster efter fixering och tvättning efter 30 min tvättning, torkning av objektglasen under natten och vidare med kresylviolett färgning nästa dag. Generellt har de flesta mRNA har specifika genexpressionsmönster, medan bakgrundssignal är mer enhetlig.

e_content "> vikta servetten kan vara vilseledande för resultat genuttryck på x-ray film, vilket leder till en region med mörkare signal. Ta reda på om vävnaden viks undersöka icke-färgade snitt i mörkfält eller kresylviolett färgade sektioner i brightfield. Cresyl violetta motfärgning ger ett bättre sätt att undersöka vävnaden skick.

För en bättre tolkning av sond specificitet bör kontroll sensprober appliceras på flera intilliggande sektioner. De flesta sensprober visar inte en signal, men vissa gör, och när de gör det, finner vi att det ofta är annorlunda än antisense signalen. Vi tror att detta kan vara relaterat till antisens-syntes eller en annan gen på antisense-strängen av genomet. Vi presenterar ett exempel Pax6 känsla och antisensprober (Fig. 2A och B). Antisense-strängen avslöjar märkning längs den ventrikulära zonen av framhjärnan, cerebellum och ögat som förväntat (Fig. 2A), men den meningen avslöjar labeling i pigmentskiktet av näthinnan (fig. 2B).

För sond storlekar, använder vi cDNA-prober som helst i intervallet 300-5000 bp. Sonder mindre än 300 bps arbete, men signalerna är oftast svagare. Vi har inte provat sonder större än 5000 bps. Det är bäst att använda prober för vävnad från samma art om möjligt. Om inte vi korshybridisera sonder på delar av andra arter och minska hybridisering och tvätta temperaturer i 3-5 ° C steg baserade på sekvensidentiteten, om känd. Om inte känt, då vi utför trial and error hybridisering och tvätta temperaturer. Om temperaturen sänks för mycket kan cDNA prob korshybridisera med andra mRNA av liknande sekvenser över arter eller i samma art 11. I praktiken finner vi att cDNA som är ~ 95% identisk eller större till mRNA-mål i vävnaden, den begränsande hybridiserings-och tvättemperatur (65 ° C) betingelser fungerar bra. För sekvenser som är i ringdees av ~ 85 till 94% identiska, hybridisering och tvätt temperaturen kan behöva minskas i intervallet ca 50 till 60 ° C.

Skälet till att använda en metall kuggstång i de flesta stegen är användningen av kloroform tvättar och xylen. Båda organiska smälta många typer av plast. Glas och vissa typer av plaster är resistenta mot dessa organiska ämnen. Men glas är lättare att bryta, och vissa plaster som vid första är resistenta kommer att smälta för längre perioder av exponering för organiska ämnen.

Figur 1
Figur 1. Autoradiografi av in-situ hybridisering bilder från x-ray filmer och emulsion doppade diabilder. (AB) röntgenfilm bilder av sagittala hela huvudet sektioner av zebra fink sångfågel vid embryonal dag 10, hybridiserades med antisens riboprober till (A) FoxP1 eller (B) CoupTF2, som tas med ljusfält belysning under ett dissektionsmikroskop. Svart, exponerade korn i filmen visar mRNA expressjon. Skalstreck = 500 ^ m. (CD) Emulsionspolymerisation doppades diabilder i sagittala hela huvudet sektioner av zebra fink vid efter kläckning dag 6, hybridiserades med antisens riboprober till (C) FoxP1 och (D) CoupTF2, som tas med mörkfält belysning enligt ett dissektionsmikroskop. Vit, exponerade silverkorn i emulsion ovan vävnaden visar mRNA uttryck. Röd, kresyl violett fläck. Skalstreck = 200 nm. För alla bilder, är det näbb rostral till vänster. De röntgenfilm bilder exponerades under en dag, doppade objektglas under 3 dagar. Den FoxP1 proben är 178 bp till 1544-1711 bp del av mRNA: t; CoupTF2 är 545 bp till 1-545 bp del av mRNA. Såsom kan ses, i framhjärnan FoxP1 mRNA anrikat i mesopallium (M), striatum (ST) och dorsala talamus (DT), medan CoupTF2 anrikas i den nidopallium (N), arcopallium (A), och mer ventrala talamus . Det finns konsekvens i uttrycket mellan exponering typer (och åldrar). Med doppade bilderna dock en högre upplösning märkning sett, end vävnad gränserna och delområdena är direkt identifieras. Dessa och alla andra bilder som visas i tidningen är från sektioner med hjälp av standarden 65 ° C med hög stringens hybridisering.

Figur 2
Figur 2. Jämförelse av antisense och känner märkning som visar olika mönster. (A) antisense-strängen av Pax6 uttrycktes i hjärnan, speciellt den ventrikulära zonen (vit pil). Som visas är autoradiografi på x-ray filmer av sagittal hela huvudet skivor tagna från zebra finch kl embryonala dag 12. (B) intill sektionen hybridiseras med sense-strängen av Pax6 avslöjar ingen bakgrund uttryck genom hela embryot huvudet, men uppenbart uttryck i pigmentskiktet av näthinnan (svarta pilar) som antisenssträngen. Den streckade linjen indikerar konturen av hela hjärnan. C: cerebellum.

Figur 3
Rong> Figur 3. In situ signaler genuttryck i emulsion doppade bilder tagna från zebra finch hjärnan under sena embryonala stadier enligt brightfield och Darkfield åsikter. (A) Brightfield bild av D1B expression vid embryonal dag 10 från en normal exponering för emulsionen. Etiketten (svart) kan knappt ses på den här förstoring. Sonden är 625 bp till 1-625 bp del av mRNA. (B) Identiska sektion och förstoring som i (A) men kopplat till mörkfält visande etiketten (vit) i striatum (ST) och talamus (TH). (C) Brightfield bild av Slit3 expression vid embryonal dag 12 från en överexponering av emulsionen. Label (svart) kan enkelt ses. Sonden är 779 bp till 1243-2021 del av mRNA. (B) Identisk avsnitt och förstoring som i (A) över till mörkfält visar etiketten (vit) i ryggmärgen (SC) som matchar brightfield bilden. Rostralt är orienterad till vänster. CB: cerebellum.

/ 3764/3764fig4.jpg "alt =" Bild 4 "/>
Figur 4. Silver korn upplösning på cellnivå. Som visas är FoxP1 mRNA etikett i zebra finch framhjärnan med silverkorn (svarta prickar) över celler (kresylviolett) i olika hjärnregioner och åldrar jämfört med lägre effekt bilder av figur 1A och 1C. (A) rikligt uttryck över enskilda celler (svarta pilar) i den vuxna zebra finch mesopallium. (B) Låg förekomst uttryck över enskilda celler (svarta pilspetsar) i det angränsande nidopallium av samma sektion. (C) Hög FoxP1 mRNA-uttryck över celler (svarta pilar) i embryonal dag 12 mesopallium. (D) Låg förekomst uttryck över celler (svarta pilar) i det angränsande nidopallium av samma sektion. Exempel celler inringade med en gul linje. Embryonala celler (C och D) är mindre och mer tätt packade jämfört med vuxna celler (A och B). Den eftersom det inte finns några mellanrum mellan cellerna och emulsion, varvid den yta av exponerat silver kornen från S 35 sonden är något större än arean av cellkropparna. Skalstreck = 10 pm.

Discussion

Radioaktivt in situ hybridisering av mRNA uttryck används i stor utsträckning för olika ändamål, bland annat för att studera regional vävnad organisation, celltyper, och hjärnan funktionell aktivitet 2-5,10,12-14. Den senare användningen är den gener vars mRNA-expression i hjärnan är beroende av ökad neural aktivitet, ofta kallade aktivitet är beroende av gener eller omedelbara tidiga gener. Med dessa användningsområden har vår metod använts i flera arter, bland annat i fåglar, däggdjur (t.ex. människa), fisk och groddjur, i flera vävnader, inklusive hjärna, hud och muskler, och flera åldrar, inklusive ungar / nyfödda, juveniler , vuxna, och här i hela embryo avsnitt 2,3,5,15-17. De särskilda funktioner på vår protokollet omfattar: (1) Det ger en balans mellan anatomiska särdrag och kvantitativa specificitet. För att kvantifiera genuttryck på x-ray film, vi tar digitala bilder på bilderna (ex:. Figur 1A och 1B), använd Photoshop (Adobe) histogramfunktionen att mäta pixeldensiteten i regionerna av intresse och subtrahera de bakgrundsnivåer på filmen utsidan av vävnaden, men ändå på objektglas 2,4. För att kvantifiera uttrycket på cellnivå, vi tar bilder av silverkorn över cellerna under hög förstoring (40-100X; fig. 4). Vi använder sedan tröskeln och funktioner mått på Image J av Wayne Rasband vid NIH att räkna antalet silverkorn i bilden, subtrahera ut bakgrunden räkningen i ett liknande område utan celler på glasskiva, dividera med antalet celler, för att få en värden uttryck per cell. 4,18 (2) Det kan vara relativt hög genomströmning, så behandlingen av 100-200 bilder samtidigt, på grund av den snäva täckglaset tätningen som skapas av mineralolja badet. Standard in situ hybridisering metoder tar längre tid att täta bilderna med parafilm, nagellack, och på andra sätt, där bilder tar upp mycket utrymme, (3) Det är mycketkänsliga för låga överflöd transkript på grund av dextransulfat och Denhardts lösning i hybridiseringsbuffert 2,13, (4) Den avbildningsteknik i mörkfält ger hög kontrast bilder på grund av fotografering i mörkfält belysning på en dissekeringsmikroskop 4,5. Dessutom tillåter det känslig detektering av små ändringar i genexpression, t.ex. i aktivitet-beroende genexpression för att identifiera specifika hjärnregioner aktiveras under perception och produktion av specifika beteenden 19. Begränsningarna i förhållande till icke-radioaktiva protokoll är att de senare är tydligare i den cellulära upplösning och placering av mRNA i cellen, och arbetar med emulsion är mycket känslig för manipulation och ljus. Det är möjligt att kombinera vår metod med andra metoder, såsom icke-radioaktiv in situ hybridisering att märka mRNA uttryck för mer än en gen i samma vävnad 10,17,20. Det kan kombineras med immunocytokemiför att märka både RNA och protein-expression på samma prov, för att sam-lokalisering av mRNA med vissa celltyper 10. Protokollhanterarna modifieringar som är nödvändiga för sådana dubbel märkning experiment beskrivs i de citerade referenserna.

Sammanfattningsvis underlättar vår strategi förståelse av tid och cellulär lokalisering av genuttryck för att förstå regionens organisation, vävnaden funktionell aktivitet och geners funktion.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka alla Jarvis lab medlemmar som förbättrat protokoll över åren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride VWR MK242002
Chloroform VWR BDH1109
Cresyl violet acetate Sigma C5042
Cryostat Thermo scientific Microm HM550
Deionized formamide Sigma F9037
DTT Promega P1171 100mM
EDTA Sigma ED
Embedding mold VWR 15160-215
Fisher brand Superfrost plus slide Fisher Scientific 22-034-979
Formaldehyde VWR BDH0506-4LP
Formamide Sigma F7508
GENECLEAN kit Q-Bio gene 1001-200
Kodak BioMax MR film Sigma Z350370
Kodak NTB Emulsion Carestream Health 8895666
Kodak Professional developer D19 Kodak 1462593
Kodak professional Fixer Kodak 1971746
β-mercapt–thanol Calbiochem 444203
Mineral oil VWR IC15169491
NaOH VWR SX0600-1
Paraformaldehyde Sigma 76240
Poly A Invitrogen POLYA.GF
rATP Promega P1132 10mM
rCTP Promega P1142 10mM
rGTP Promega P1152 10mM
RNasin Promega N2111 40Units/μl
S35 UTP PerkinElmer NEG039C001MC
Safety-Solve solution Safety Solve Research Products International 111177
Sodium Acetate Sigma S7899 3M
Sodium phosphate dibasic Sigma S3264
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
SP6 RNA polymerase Promega P1085
Staining metal rack Electron Microscopy Sciences 70312-54
T7 RNA polymerase Promega P2075
Tissue-Tek OCT Sakura 4583
5x Transcription buffer Promega P1181
Triethanolamine VWR IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) VWR 101449-446
tRNA Roche 10109509001

Solutions:
  1. Reagents for making of riboprobes: 1.5 μl DNA template (0.2-0.3 μg/μl), 2 μl of 5x optimized transcription buffer, 1 μl of 100mM DTT (comes with Polymerase from Promega, mix well at room temperature), 0.3 μl of RNasin (40 units/μl), 1.5 μl of AGC ribonucleotide mix solution, 3.5 μl of S35 UTP, and 1 μl RNA polymerase. Bring up to 10 μl with nuclease-free water.
  2. AGC ribonucleotide mix solution: mix equal amounts of 10mM ATP, GTP and CTP together.
  3. Sodium acetate solution for EtOH precipitation to remove free S35 UTP: 40 μl RNase and DNase free water, 5 μl of 3M Sodium Acetate, and 125 μl of 100% EtOH.
  4. Hybridization buffer (10ml stock): 5 ml of 100% deionized formamide, 600 μl of 5M NaCl, 1M tris-HCl (pH = 8.0), 240 μl of 0.5M EDTA (pH =8.0), 100 μl of 100x Denhart's solution, 100 μl of 1M DTT, 250 μl of 20mg/ml tRNA, 125 μl of 20 mg/ml poly A, and 1 g of Sodium Dextran Sulfate. Add DEPC-treated water to bring the total volume to 10 ml. Shake vigorously and then incubate at 55 °C until all sodium dextran sulfate is dissolved. Store the hybridization buffer in -20 °C, which is good for ~6 months.
  5. 4% buffered paraformaldehyde solution: Add 40 g of paraformaldehyde in 760 ml distilled water in a flask designated for paraformaldehyde, heat to 50 °C on a hot plate while stirring. Add 320 μl of 10N NaOH to help dissolve the paraformaldehyde. After dissolving (~10 min), add 100 ml of 10x PBS, and bring the volume up with distilled water until 1 liter. Stir and heat the solution until paraformaldehyde is dissolved. The pH should be 7.4.
  6. Acetylation buffer: 13.6 ml of triethanolamine plus 2.52 ml of acetic anhydride in 1 liter of distilled water.
  7. 20x SSPE solution: 3M NaCl, 200 mM NaH2PO4-H2O, and 200 mM EDTA in distilled water. Adjust solution to pH 7.4 with 10N NaOH.
  8. 10x PBS buffer: 80g of NaCl, 2.0g of KCl, 14.4g of Na2HPO4, and 2.4g of KH2PO4 in distilled water. Adjust solution to pH 7.0 and bring total volume to 1 liter.
  9. Second wash solution: 0.1% β-mercapt–thanol and 50% formamide in 2x SSPE
  10. Cresyl violet acetate solution: 3% cresyl violet acetate in tap water (distilled water prevents good staining), dissolved overnight with stirring in a flask at room temperature. Filter with vacuum suction through a 1mm Whatman filter paper and Buchner funnel.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
  2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
  3. Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  4. Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
  5. Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
  6. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
  7. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  8. Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
  9. Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
  10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
  11. Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
  12. Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
  13. Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
  14. Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  15. Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
  16. Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363 (2005).
  17. Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
  18. Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
  19. Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768 (2008).
  20. Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).

Tags

Neuroscience , radioaktiva riboprober vertebrat embryo silver emulsion mörkfält genetik
Radioaktivt<em> In situ</em> Hybridisering för Upptäcka Diverse Mönster genuttryck i Tissue
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. … More

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. J. Vis. Exp. (62), e3764, doi:10.3791/3764 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter