Summary
Dit protocol wordt met succes gebruikt om kwantitatief te detecteren niveaus en ruimtelijke patronen van mRNA-expressie in verschillende weefsels vormen over gewervelde soorten. De methode kan detecteren lage abundantie transcripties en maakt het verwerken van honderden dia's tegelijk. We presenteren dit protocol met behulp van expressie profilering van aviaire embryonale hersenen formatie als voorbeeld.
Abstract
Kennis van de timing, niveau cellulaire lokalisatie en celtype dat een gen uitgedrukt in draagt voor ons begrip van de werking van het gen. Elk van deze voorzieningen kan worden uitgevoerd met in situ hybridisatie aan mRNA in de cellen. Hier vormen een radioactieve in situ hybridisatie werkwijze gemodificeerd uit Clayton et al. (1988). Die een succesvol in ons laboratorium werken jaren, in het bijzonder voor volwassenen gewervelde hersenen 2-5. De lange complementaire RNA (cRNA) probes aan de doelsequentie zorgt voor detectie van lage abundantie heeft transcripties 6,7. Integratie van radioactieve nucleotiden in de cRNA probes kunnen verdere detectiegevoeligheid van geringe hoeveelheden transcripts en kwantitatieve analyse, door lichtgevoelige röntgenfilm of emulsie bekleed op het weefsel. Deze detectiemethoden een langdurige staat van expressie van het doelwitgen. Vergeleken met niet-radioactieve probe methODS zoals DIG etiketteren, is de radioactieve probe hybridisatie methode geen meerdere amplificatie stappen met HRP-antilichamen en / of TSA kit lage hoeveelheden transcripten detecteren. Daarom is deze werkwijze verschaft een lineaire relatie tussen signaal intensiteit en gerichte mRNA bedragen voor kwantitatieve analyse. Het maakt het mogelijk verwerken van 100 tot 200 dia's tegelijk. Het werkt goed voor de verschillende ontwikkelingsstadia van embryo's. De meeste ontwikkelings-studies van de genexpressie te gebruiken gehele embryo's en niet-radioactieve benaderingen 8,9, voor een deel omdat embryonaal weefsel is kwetsbaarder dan volwassen weefsel, met minder cohesie tussen de cellen, waardoor het moeilijk is om grenzen tussen celpopulaties met weefselcoupes te zien. Daarentegen onze radioactieve benadering door het grotere aantal gevoeligheid kan hoger contrast te verkrijgen oplossing van genexpressie tussen weefsel gebieden maakt het gemakkelijker om grenzen tussen populaties zien. Met deze methode kunnen onderzoekers onthullen demogelijke betekenis van een nieuw geïdentificeerd gen, en verder voorspellen de functie van het gen van belang.
Protocol
1. Tissue Voorbereiding
- Oogst verse weefsels. Voor aviaire embryo's, zorgvuldig te openen eieren en maak het embryo in een schaal met 1xPBS, twee keer. Voor volwassen hersenen, snel te verwijderen van de hersenen en voorzichtig wassen met 1 x PBS.
- Embedden embryo's of volwassen hersenen in een embedded mal vol oktober weefsel tek, richten van de weefsel als nodig is voor het snijden, en snel het blok bevriezen door het plaatsen van het in een ethanol en droog ijs mengsel, zorg dat u het mengsel te krijgen binnenkant van het blok .
- Snijd de bevroren monster in een cryostaat in 10-12 urn dikke secties. Voor hersenen en embryonale weefsel, het snijden beste gematigde binnen het bereik van -18 ° C tot -20 ° C.
- Monteer vriescoupes op super plus glazen dia's.
- Bewaar de secties in een dia doos bij -80 ° C.
2. Productie van radioactief riboprobes (Gebruik straling veiligheidsprocedures van uw instelling)
- Genereer een gezuiverd lineair DNEen model van cDNA van belang hetzij enzym beperkte digest van een gekloneerd fragment omgeven door RNA polymerase promoter plaatsen van een plasmide DNA of door PCR van het inzetstuk aan de RNA-polymerase promoter bindingsplaatsen. Het is ook mogelijk om in PCR-fragmenten met de RNA-polymerase-promotors in het kader van de 3 'en 5' PCR primers. Gels zuivert uw beperkte of PCR gegenereerd fragmenten met de Geneclean gel zuivering kit.
- Met 0,5 ml eppendorfbuisje toevoegen 0,5-1 ug gezuiverd lineaire DNA-template, transcriptie buffer, DTT, RNAsin AGC nucleotide mix oplossing en RNase vrij water tot het volume aan te passen aan de gewenste hoeveelheid. Voeg vervolgens S 35-UTP en de juiste RNA-polymerase om ofwel antisense of sense riboprobes te maken.
- Incubeer het mengsel gedurende 1 uur in een 37 ° C waterbad. Voeg nog een hoeveelheid van RNA-polymerase en incubeer nog eens 1 uur.
- Voeg 3M natriumacetaatoplossing (0,1 maal de totale volume) en 100% EtOH (2,5 fold van het totale volume) in de eppendorfbuisje voor het neerslaan van de gesynthetiseerde RNA riboprobe.
- Incubeer in droogijs of -80 ° C gedurende 15 min of meer dan 3 uur staan neerslag.
- Pellet RNA door centrifugeren bij 4 ° C en 15.000 rpm in een tafelblad Eppendorf centrifuge gedurende 30 minuten.
- Verwijder het supernatant en was de pellet met 70% EtOH, tikt met een vinger om goed te mengen de pellet.
- Pellet RNA opnieuw door centrifugeren bij 4 ° C en 15.000 rpm gedurende 30 minuten.
- Volledig Verwijder de bovenstaande vloeistof door het pipetteren en voeg dan 40 pi hybridisatie-oplossing. Meng goed door het pipetteren in en uit.
- Doe 1 ul van de oplossing in 3 ml Safety-Solve oplossing in de scintillatieflesje, meng goed, en meet de tellingen in de scintillatieteller.
- Plaats Eppendorf de riboprobe bij -20 ° C voor gebruik in een week.
3. Tissue behandeling
- In een kap, voor te bereiden verse PBS gebufferde 4% paraformaldehyde oplossing ongeveer 3-5 ° C boven kamertemperatuur. Place dia van -80 ° C opgeslagen in een metalen rek op droogijs, dragen om samen ruimte onder de kap en de rek plaats in de 4% paraformaldehyde oplossing en geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was 3 keer in 1 x PBS ongeveer 15 dips per stuk (ongeveer 1 seconde per dip).
- In de afzuigkap moeten acetylering buffer en krachtig schudden het binnen 10 seconden. Onmiddellijk giet het in een lade met het rek van dia's en incubeer gedurende 10 minuten op de achtergrond binding van riboprobe te verminderen.
- Spoel 3 keer in 2 x SSPE voor 15 dips.
- Uitdrogen in 70%, 95% en 100% EtOH seriële gedurende 2 minuten in elke stap (hoeft niet in de kap).
- Droog de dia's onder de motorkap voor minstens 10-15 minuten.
4. Hybridisatie
- Bereken hoeveelheid riboprobe (0,5-1x10 6 cpm per dia) en hybridisatie-oplossing (100 ul per dia) die nodig is voor alle dia's. Prewarm de riboprobe-hybridisatiemengsel tot 65 ° C gedurende 5 min op de riboprobe denatureren.
- Pipetteer 100 ul van riboprobe-hybridisatie-oplossing in een lijn over de glijbaan, en gebruik een glazen dekglaasje te Verdeel het gelijkmatig over de weefsel-en dekglaasje aan. Plaats de glaasjes horizontaal, tegenover rechtop in een metalen rooster en plaats rek langzaam rechtop in de 65 ° C oliebad voor een minimum van 4 uur en een maximum van 16 uur. De olie zorgt voor een luchtdichte afsluiting rond de dekglaasjes.
- Verwijder de metalen rekken uit de olie-bad en veeg de overtollige olie rond rek met vloeipapier.
- Was olie uit de overdekte glijbanen en metalen rek in glas of metaal, laden met chloroform, twee keer. Het 2 chloroform wassen kunnen worden gebruikt als eerste van het volgende experiment.
- Zet het rek met overdekt dia's in een lade met in 0,1% β-mercapto-ethanol + 2 x SSPE oplossing en op en neer bewegen voor een paar dips te dekglaasjes los en verwijder overtollig hybridisatie oplossingen te ontbindenTIE.
- Breng het rek met overdekt schuift verse oplossing van 0,1% β-mercapto-ethanol + 2 x SSPE, en dekglaasjes verwijderen met een RNase vrije tang in oplossing voorkomen krassen weefselcoupes. Breng de onbedekte overgaat in vers rooster in een tray horizontale schuif rek houder in een oplossing van 0,1% β-mercaptoethanol in 2 x SSPE.
- Incubeer de rek met dia in de verse 0,1% β-mercapto-ethanol + 2 x SSPE oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur om overmaat ongebonden RNA probe verwijderen. Gooi de vorige en de waterige wasoplossingen, alsmede dekglaasjes als radioactief afval.
- Breng het rek met een dia voorverwarmde 2x SSPE oplossing bij 65 ° C, voeg β-mercapto-ethanol tot een uiteindelijke concentratie van 0,1%, en incuberen bij 65 ° C gedurende 1 uur. Gooi als radioactief afval.
- Breng en incuberen het rek met dia twee keer voorverwarmde 0,1 x SPPE bij 65 ° C gedurende 30 min elk. De hoeveelheid radioactiviteit verwijderdDeze stap is zeer klein en niet langer beschouwd als overmatige radioactief afval na deze stap.
- Dehydrateer de rek en dia's in 70%, 95% en 100% EtOH gedurende 2 minuten elk.
- Droog de dia in de kap tenminste 30 minuten.
5. Visualisatie van radioactief Signal
- Plaats droge dia's in een film cassette en in een donkere kamer, de x-ray film (Kodak Biomax MR film) plaats over de dia's, en sluit de cassette. Zorg ervoor dat de dia's worden de emulsie kant van de x-ray film gericht. Expose de dia's voor ~ 1-7 dagen, afhankelijk van de verwachte overvloed van de transcripten.
- Ontwikkeling van de x-ray film in standaard ontwikkelaar en fixeer. De hybridisatie signalen toont als zwarte (belichte zilverhalogenide korrels in de emulsie) op de film (Fig. 1).
- (Optioneel) cellulaire resolutie te bepalen en te zien signaal op het weefsel, de dia's moeten worden gedoopt in fotografische emulsie en tegengekleurd.Gaat u uiteindelijk tegenkleuring met cresyl violet dan delipidize delen door incubatie in xyleen gedurende 5 min bij kamertemperatuur tweemaal 1 min hydrateren elk op 100% 100%, 95%, 95%, 70% en 50% EtOH en vervolgens in gedeïoniseerd water. Als u niet van plan om vlekken met een kleurstof die niet vereist dat delipidization, dan delipidization is niet nodig. Droge dia's goed onder een kap voor minstens 2-3 uur.
- In de donkere kamer met een veilige licht, schep genoeg Kodak NTB emulsie tot de helft van de foto de lengte (dat wil zeggen weefsel) in glas dompelen container te dekken, en daarna smelten in een 42 ° C waterbad gedurende 20-30 minuten. Dan verdunnen met gedestilleerd water tot 1:1 verhouding. Het niveau van de emulsie nu alle delen op een dia wanneer de dia gedompeld in. Als je veel dia's, moet u mogelijk extra emulsie te bereiden.
- Dip dia's in de verdunde emulsie in de 42 ° C waterbad en droog gedoopt dia's in een gesloten lichte strakke container overnight in de donkere kamer, of in een oven bij 37 ° C gedurende 2-3 uur met licht uit.
- Breng de dia's in rekken sleuven in zwarte dozen met Exsiccatoren, en let op voor de dia's niet op elkaar aan te raken en bijgevolg tot artefacten. De randen van de dozen met zwarte isolatieband langzaam statische geïnduceerde licht vonken voorkomen en de dozen verpakken in aluminiumfolie. Bewaar de dozen bij 4 ° C van enkele dagen of weken (signaal van 1 dag op röntgenfilm is gelijk aan 5 dagen onder emulsie).
- Verwarm de dia dozen op kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- In de donkere kamer, te verwijderen rek met dia's (of de locatie dia's in een metalen rek bij gebruik van dozen met glijbaan slots) uit de dozen en ontwikkelen ze in de Kodak D-19 ontwikkelaar bij 16 ° C gedurende 3,5 minuten.
- Was de ontwikkelde dia in leidingwater bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
- Tweemaal Incubeer de glaasjes in fixeermiddel op 19 ° C gedurende 6 min elk. Licht kan worden ingeschakeld tijdens de tweede fixer incubatie. Was de dia's in stromend water op kamertemperatuur gedurende tenminste 30 minuten en schraap de emulsie van de achterkant van de schuif, terwijl 'natte' met een scheermesje om te voorkomen krassen op het glas.
- Vlek weefsel met 0,3% cresyl violet in leidingwater gedurende 5 minuten.
- Was extra cresyl violet oplossing in vers leidingwater voor ~ 15 dips.
- Drogen de geleiders voor ~ 15 dips per alcohol oplossing 50%, 70%, 95%, 95%, 100% en 100% EtOH.
- Incubeer de glaasjes in xyleen gedurende 5 min bij kamertemperatuur tweemaal.
- Coverslip met Permount medium op de dia en droog de overdekte glijbaan in de kap 's nachts (> 16 uur), maar zal enkele dagen duren voordat de lijm stevig genoeg is om verder te reinigen van de dia's.
6. Het genereren van Darkfield Kleurenafbeeldingen
- Zo nodig kunnen reinigen overmaat emulsie op de achterzijde van de glijbanen (niet coversliped zijde zonder weefsel) door bevochtigen met water en schrapen met een scheermes. <li> Spoel dia's met 80% EtOH-oplossing en zachtjes 1-2 keer om zich te ontdoen van vuil en stof af te vegen.
- Maak foto's onder donkerveld of helderveld verlichting. Stappen 6.2 en 6.3 kunnen worden 2-3 keer herhaald om een goede beelden te verkrijgen zonder stof, die gemakkelijk in donkerveld gezien onder een stereomicroscoop.
7. Representatieve resultaten
Het zijn twee manieren van kijken in situ hybridisatie resultaten op weefselcoupes gehybridiseerd met S 35 radioactieve probes: 1) x-ray film die werd geplaatst over de dia's of 2) emulsie die werd aangebracht op de dia's. Een derde benadering is het gebruik van een fosforimager scherm geplaatst over de dia's, maar we zijn niet tevreden met de resolutie van deze aanpak. X-ray films geven een snel resultaat en analyses van de algemene toestand van de hybridisatie. De x-ray film gegevens blijkt ook een brede anatomische resolutie en kan gebruikt worden voor kwantitatieve analys10. Voorbeelden van x-ray film beelden van late aviaire embryo hoofden gehybridiseerd met antisense probes voor FOXP1 en CoupTF2 genexpressie zijn in figuur 1a en b. Beide genen zijn zeer talrijk in specifieke hersengebieden onderverdelingen. Een goede kwaliteit x-ray film resultaat moet scherp zijn (niet wazig) en hebben een hoge signaal-achtergrond verhouding. Een wazig beeld kan te wijten zijn aan de ongelijke contact tussen een x-ray film en de glazen dia met de gehybridiseerde weefsel.
Voor emulsie gedompeld dia de emulsie lichtgevoelige zilverzouten gecoat weefsel apposed aan dat de kunststof van de x-straal film. Tijdens de ontwikkeling, de S 35-belichte zilverhalogenide zouten worden omgezet zilverkorrels metalen, net als in de x-straal film. Echter, de zilveren deposito's direct zichtbaar zijn over de cellen die genexpressie die kunnen worden waargenomen als kwalitatief gemeten onder een microscoop. De metallic zilver granen te blokkeren direct licht dooren verschijnen als de zwarte puntjes onder helderveld uitzicht. De cresyl violet tegenkleuring verschijnt paars van kleur (fig. 3A, 3C, en Fig. 4). In donkerveld, de zilverkorrels reflecteren licht dat van opzij en verschijnen als de witte stippen (afb. 1C, 1D, 3B en 3D). In deze situatie is de cresyl vlek violet verschijnt rood van kleur. In brightfield het hybridisatiesignaal gemakkelijker te maken onder een hoge vergroting op cellulair resolutie, terwijl donkerveld bovendien de hybridisatie signaal kunnen worden bekeken onder een kleinere vergroting over de gehele weefsel. De donkerveld uitzicht is de aanpak die we gewoonlijk gebruiken om de algehele genexpressie patroon laten zien. Echter ten opzichte van de snel resultaat van röntgenfilms, de emulsie gedimde dia duurt langer (een tot enkele weken) en is gevoelig voor het verkrijgen achtergrond.
Er zijn vier veel voorkomende oorzaken van sterke achtergrond: 1) Achtergrond over de x-ray film wordt meestal doen omproblemen met de ontwikkelaar of fixeer, of gedeeltelijk belichte film, 2) Achtergrondinformatie over de glazen dia's is meestal te wijten aan problemen met wassen of glasplaatje voorbereiding, zoals onjuiste silination van de dia's van de commerciële bron of zelf-en-klaar, 3) Emulsion belichting en ontwikkeling achtergrond en 4) Achtergrond van de sectie door een gebrek aan zorgvuldige na hybridisatie wasstappen een te laag hybridisatietemperatuur, slechte kwaliteit van de hybridisatie-oplossing, paraformaldehyde besmetting afwassen waardoor probes permanent verknopen het weefsel, riboprobe afbraak waardoor kleine moleculen labelen van de weefsel-specifiek, inactieve DTT of β-mercapto-ethanol waardoor verknoping van S 35 RNA probes in di-sulfide bindingen met het weefsel en te lang wachten acetylering. Het is cruciaal om de dia's in de acetylering oplossing hebben binnen enkele seconden van het mengen van de azijnzuuranhydride en triethanolamine. Als een paar minuten voorbij without toevoeging van de oplossing om de dia dan acetylgroepen niet efficiënt worden verwijderd en binden van niet-specifiek RNA. Andere factoren zijn hybridisatie dan 20 uur, die genereren te sterk van een signaal, en overmaat oliedruppeltjes in de dia die hybridisatieoplossing sekwestreren van de dia tijdens waterige wassen, waardoor radioactieve vlekken op het weefsel en schuift donkere achtergrond geven signalen. Als het werken met veel dia's (meer dan 100 schijfjes), voeg er 3 e chloroform te wassen of wijzigen van de chloroform wast, om het teveel aan olie deeltjes te voorkomen dat nog op de dia's. Careless weefsel behandeling, dat wil zeggen niet het bevriezen van snel genoeg (binnen 5-10 minuten na dissectie) of ontdooien en opnieuw invriezen verhoogt ook de achtergrond als gevolg van degradatie mRNA. Wees voorzichtig niet te verwarren met achtergrond over de belichting.
Voor emulsie achtergrondinformatie over de gedimde dia's is mogelijk omdat het is zeer lichtgevoelig en vereist long-exposure in het donker. Com Maan achtergrond problemen zijn onder meer te hoge temperatuur voor de ontwikkelaar en fixeer. Wanneer de temperatuur hoger is dan 19 ° C, vlak of warmer dan kamertemperatuur, meer zilverkorrels achtergrond verkregen. Blootstelling aan lage niveaus van licht lekken in een donkere kamer zal emulsie achtergrond. Niet uitwassen fixer lang genoeg (minstens 30 minuten in stromend water), laat fixer die dan reageert met cresyl violet voor het genereren van een bruinachtige neerslag in de emulsie. Echter, als de dia's worden gewassen in water langer dan 90 min na fixatie voor cresyl violet vlekken, want daardoor kan de emulsie los komen te zitten en de secties slecht vlek. Als er niet genoeg tijd om de dia's vlek binnen een 30-90 minuten venster na fixatie en wassen, na de 30 min was, 's nachts Droog de glaasjes en ga verder met cresyl violet kleuren van de volgende dag. Algemeen meeste mRNAs specifieke genexpressiepatronen, dat achtergrondsignaal gelijkmatiger.
e_content "> Gevouwen weefsel misleidend kunnen zijn voor genexpressie resultaten op x-ray film, wat leidt tot een regio met een donkere signaal. Om te bepalen of het weefsel is gevouwen, niet-gekleurde coupes onderzoeken op donkerveld of cresyl violet gekleurde coupes onder helderveld. cresyl violet tegenkleuring biedt een betere manier om het weefsel heeft onderzocht.Voor een betere interpretatie van de sonde specificiteit, moet controle zin sondes worden toegepast op verschillende aangrenzende secties. De meeste zin sondes wijzen niet op een signaal, maar wat doen en wanneer ze dat doen, vinden we dat het vaak anders is dan de antisense-signaal. Wij zijn van mening dat dit kan te maken hebben met synthese of een ander gen op de antisense streng van het genoom antisense. We presenteren een voorbeeld PAX6 sense en antisense probes (afb. 2A en B). De antisense streng onthult etikettering langs de ventriculaire zone van de voorhersenen, de kleine hersenen en ogen zoals verwacht (Fig. 2A), maar de betekenis onthult laketteer machines in de pigmentlaag van de retina (Fig. 2B).
Voor probe maten we cDNA probes in het bereik van 300-5000 bps. Probes minder dan 300 bps werk, maar de signalen zijn meestal zwakker. We hebben niet geprobeerd probes groter dan 5000 bps. Het beste is om probes op weefsel te gebruiken van dezelfde diersoort, indien mogelijk. Zo niet, dan steken we-hybridiseren probes op delen van andere soorten en verminderen de hybridisatie en was de temperatuur in 3-5 ° C in stappen op basis van sequentie-overeenkomst, indien bekend. Als dat niet bekend is, dan voeren we met vallen en opstaan hybridisatie en wassen temperaturen. Als de temperatuur veel lager kan de cDNA probe kruislings hybridiseren met andere mRNA's van dergelijke sequenties tussen soorten of dezelfde species 11. In de praktijk zien we dat cDNA's die ~ 95% identiek is aan of groter dan het mRNA doel in het weefsel, de stringente hybridisatie en was de temperatuur (65 ° C) omstandigheden goed werkt. Voor sequenties die in de ranges van ~ 85 tot 94% identiek de hybridisatie en was temperatuur moet worden verminderd in het bereik van ~ 50 tot 60 ° C.
De reden voor het gebruik van een metalen rooster in de meeste van de stappen is het gebruik van chloroform wassen en xyleen. Beide organische smelten vele soorten kunststoffen. Glas en sommige soorten kunststof resistent zijn tegen deze organische stoffen. Maar glas gemakkelijk breken en dat sommige kunststoffen eerste resistent zijn smelt over lange perioden van de organische.
Figuur 1. Autoradiografie van in-situ hybridisatie beelden van x-ray films en emulsie gedoopt dia's. (AB) X-ray film beelden van de sagittale hele kop delen van de zebravink zangvogel op embryonale dag 10, gehybridiseerd met antisense riboprobes aan (A) FOXP1 of (B) CoupTF2, genomen met helderveld verlichting onder een stereomicroscoop. Zwart, blootgesteld granen in de film laten zien mRNA uitdrukkelijkeion. Schaal bar = 500 pm. (CD) Emulsie dia's van de sagittale hele kop delen van de zebravink gedoopt op post luik dag 6, gehybridiseerd met antisense riboprobes tot (C) FOXP1 en (D) CoupTF2, genomen met donkerveld verlichting onder een dissectie microscoop. Wit, belichte zilverhalogenide korrels in emulsie boven weefsel met mRNA expressie. Rood, cresyl violet vlek. Schaal bar = 200 micrometer. Voor alle foto, de snavel is rostraal van de links. De x-ray filmbeelden werden blootgesteld voor een dag, gedoopt dia's voor 3 dagen. De FOXP1 sonde 178 bps de 1544-11 bp van het mRNA; CoupTF2 545 bps de 1-545 bp van het mRNA. Zoals in de voorhersenen FOXP1 mRNA verrijkt in het mesopallium (M), striatum (St) en dorsale thalamus (DT), terwijl CoupTF2 verrijkt in het nidopallium (N), arcopallium (A) en ventrale thalamus . Er is consistentie in expressie tussen blootstelling types (en leeftijden). Met de gedimde dia wordt echter een hogere resolutie labeling gezien, eend weefsel grenzen en sectoren worden direct geïdentificeerd. Deze en andere afbeeldingen in het papier zijn van profielen met de standaard 65 ° C hoge stringentie hybridisatie.
Figuur 2. Vergelijking van antisense en het gevoel dat de etikettering verschillende patronen laat zien. (A) De antisense streng PAX6 werd uitgedrukt in de hersenen, vooral de ventriculaire zone (witte pijl). Afgebeeld is autoradiografie op de x-ray films van sagittale hele hoofd plakken uit zebravink op embryonale dag 12. (B) Aangrenzend sectie gehybridiseerd met de sense streng van PAX6 onthult geen achtergrond expressie in het embryo hoofd, maar duidelijk tot uiting in de pigmentlaag van de retina (zwarte pijlen) als de antisense streng. De stippellijn geeft de contour van de gehele hersenen. C: kleine hersenen.
/ 3764/3764fig4.jpg "alt =" Figuur 4 "/>
Figuur 4. Silver graan resolutie op cellulair niveau. Afgebeeld is FOXP1 mRNA label in de zebravink voorhersenen met zilveren korrels (zwarte punten) boven de cellen (cresyl violet) in verschillende gebieden van de hersenen en leeftijden in vergelijking met een lager vermogen beelden van figuur 1A en 1C. (A) High overvloed expressie over afzonderlijke cellen (zwarte pijlen) in de volwassen zebravink mesopallium. (B) Lage overvloed expressie over afzonderlijke cellen (zwarte pijlen) in de aangrenzende nidopallium van dezelfde sectie. (C) Hoge FOXP1 mRNA-expressie op cellen (zwarte pijlen) in de embryonale dag 12 mesopallium. (D) Laag overvloed expressie op cellen (zwarte pijlen) in de aangrenzende nidopallium van dezelfde sectie. Voorbeeld cellen worden omringd met een gele lijn. Embryonale cellen (C en D) kleiner en dichter gepakt vergeleken met de volwassen cellen (A en B). De omdat er enige ruimte tussen de cellen en emulsie gebied van blootgestelde silver korrels van de S 35 probe enigszins groot is dan de oppervlakte van de cellichamen. Schaal bar = 10 micrometer.
Discussion
Radioactieve in situ hybridisatie van mRNA-expressie wordt veel gebruikt voor meerdere doeleinden, waaronder voor het bestuderen van regionale weefsel organisatie, celtypen, en de hersenen functionele activiteit 2-5,10,12-14. De later te gebruiken is op genen waarvan de mRNA expressie in de hersenen is afhankelijk van meer neurale activiteit, ook wel activiteit-afhankelijke genen of onmiddellijke vroege genen. Met deze toepassingen, is onze methode is toegepast op meerdere soorten, waaronder bij vogels, zoogdieren (bijvoorbeeld mens), vissen en amfibieën, in meerdere weefsels, zoals hersenen, huid en spieren en meerdere leeftijden, inclusief jongen / pasgeborenen, jongeren , volwassenen, en hier in zijn geheel embryo secties 2,3,5,15-17. De speciale kenmerken van ons protocol zijn onder andere: (1) Het produceert een evenwicht tussen anatomische specificiteit en kwantitatieve specificiteit. Om de expressie van genen te kwantificeren op de x-ray film, we digitale foto's van de beelden (. Ex: Fig 1A en 1B) te nemen, gebruik maken van de Photoshop (Adobe) histogram functie om de pixel dichtheid te meten in de regio's van belang en trek de achtergrondniveaus op de film buitenkant van het weefsel, maar nog steeds op de glasplaatje 2,4. Om uitdrukking te kwantificeren op cellulair niveau, nemen we beelden van zilverkorrels meer dan cellen onder een sterke vergroting (40-100X; Figuur 4). Daarna de drempel en meet functies beeld J gebruik door Wayne Rasband bij NIH het aantal zilverkorrels tellen in het beeld van aftrekken van de achtergrond aantal in een soortgelijk gebied zonder cellen op het glaasje, gedeeld door het aantal cellen, een waarde van expressie per cel. 4,18 (2) relatief hoge doorvoer zijn, zodat verwerking van 100-200 dia gelijktijdig door de nauwe dekglaasje afdichting die door de minerale oliebad te verkrijgen. Standaard in-situ hybridisatie methoden langer duren om de dia's met parafilm, nagellak en andere middelen, waar de dia's nemen veel ruimte af te dichten, (3) Het is zeergevoelig voor lage abundantie transcripten te wijten aan dextransulfaat en Denhardt's oplossing in de hybridisatiebuffer 2,13; (4) De imaging aanpak in donkerveld levert beelden met hoog contrast te wijten aan het nemen van foto's onder donkerveld belichting op een stereomicroscoop 4,5. Bovendien, Het maakt het mogelijk gevoelige detectie van kleine veranderingen in genexpressie, zoals de activiteit-afhankelijke genexpressie worden bepaald welke specifieke gebieden van de hersenen geactiveerd tijdens de perceptie en productie van specifiek gedrag 19. De beperkingen ten opzichte van niet-radioactieve protocollen dat deze duidelijker in de cellulaire resolutie en locatie van het mRNA in de cel en het werken met emulsie is zeer gevoelig voor manipulatie en licht. Het is mogelijk om onze methode combineren met andere methoden, zoals niet-radioactieve in situ hybridisatie mRNA expressie van meerdere genen in dezelfde weefsel 10,17,20 labelen. Het kan worden gecombineerd met immunocytochemiezowel RNA en eiwitexpressie label op hetzelfde monster om co-lokalisatie van de mRNA bepaalde celtypen 10. Het protocol aanpassingen noodzakelijk dat deze dubbele etikettering experimenten beschreven in de geciteerde referenties.
In het kort, onze aanpak vergemakkelijkt inzicht in de timing en cellulaire locatie van genexpressie in om het begrijpen van regio organisatie, weefsel functionele activiteit, en de functie van een gen.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag alle Jarvis lab leden die het protocol verbeterd door de jaren heen bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | VWR | MK242002 | |
| Chloroform | VWR | BDH1109 | |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Cryostat | Thermo scientific | Microm HM550 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | |
| DTT | Promega | P1171 | 100mM |
| EDTA | Sigma | ED | |
| Embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Fisher brand Superfrost plus slide | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | |
| Formamide | Sigma | F7508 | |
| GENECLEAN kit | Q-Bio gene | 1001-200 | |
| Kodak BioMax MR film | Sigma | Z350370 | |
| Kodak NTB Emulsion | Carestream Health | 8895666 | |
| Kodak Professional developer D19 | Kodak | 1462593 | |
| Kodak professional Fixer | Kodak | 1971746 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Mineral oil | VWR | IC15169491 | |
| NaOH | VWR | SX0600-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | |
| Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | |
| rATP | Promega | P1132 | 10mM |
| rCTP | Promega | P1142 | 10mM |
| rGTP | Promega | P1152 | 10mM |
| RNasin | Promega | N2111 | 40Units/μl |
| S35 UTP | PerkinElmer | NEG039C001MC | |
| Safety-Solve solution | Safety Solve Research Products International | 111177 | |
| Sodium Acetate | Sigma | S7899 | 3M |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| SP6 RNA polymerase | Promega | P1085 | |
| Staining metal rack | Electron Microscopy Sciences | 70312-54 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P2075 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 5x Transcription buffer | Promega | P1181 | |
| Triethanolamine | VWR | IC15216391 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | VWR | 101449-446 | |
| tRNA | Roche | 10109509001 | |
Solutions: |
|||
|
|||
References
- Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
- Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
- Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
- Jarvis, E. D., Nottebohm, F.
- Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
- Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
- Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
- Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
- Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
- Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
- Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
- Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
- Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
- Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
- Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363 (2005).
- Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
- Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
- Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768 (2008).
- Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).
