Summary
घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स (ORNs) गंध संकेतों एक रिसेप्टर में पहली परिवर्तित वर्तमान है कि बदले में कार्रवाई की क्षमता है कि घ्राण बल्ब में दूसरे क्रम न्यूरॉन्स को अवगत करा रहे हैं से चलाता है. यहाँ हम चूषण विंदुक के लिए एक साथ odorant प्रेरित रिसेप्टर वर्तमान और माउस ORNs से ऐक्शन पोटेंशिअल रिकॉर्ड तकनीक का वर्णन करता है.
Protocol
1. रिकॉर्डिंग सेटअप
रिकॉर्डिंग चैम्बर एक Nikon चरण विपरीत प्रकाशिकी जो एक हवा मेज पर फिट है और विद्युत एक फैराडे पिंजरे का उपयोग परिरक्षित के साथ TE2000U ग्रहण औंधा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की है. Plexiglass रिकॉर्डिंग कक्ष दो वर्गों के आंशिक रूप से एक बाधा द्वारा अलग और एक silanized गिलास स्लाइड पर चिपके होते हैं. चैम्बर के एक भाग के लिए कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए, जबकि अन्य प्रोत्साहन जोखिम के लिए रिकॉर्डिंग के दौरान प्रयोग किया जाता है odorant बसे समय से पहले जोखिम, लेकिन अभी तक अप्रयुक्त कोशिकाओं को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है. रिकॉर्डिंग सेटअप एक चूषण (नीचे देखें) विंदुक एक pelleted विंदुक धारक और एक जमीन इलेक्ट्रोड में घुड़सवार के होते हैं. चूषण विंदुक एक micromanipulator का उपयोग तैनात है. प्रोत्साहन समाधान एक गिलास ट्रिपल बैरल वर्ग ट्यूब का उपयोग करते हुए प्रत्येक वर्ग ट्यूब 0.7 मिमी x 0.7 मिमी होने के साथ, लागू होते हैं. कांच ट्रिपल बैरल एक motorized तेजी से कदम छिड़काव जोड़तोड़ पर घुड़सवार प्रणाली (Sut से जुड़ा थाSF-77B आतंकवाद, वार्नर इंस्ट्रूमेंट्स) और ° ~ 45 के एक कोण पर रिकॉर्डिंग कक्ष में प्रवेश किया. ट्रिपल बैरल कांच के अंत में फिर से 45 ऐसी है कि ट्रिपल बैरल कांच के अंतिम चेहरा (प्रारंभिक) विंदुक के करीब स्थिति की अनुमति के लिए खड़ी थी डिग्री के कोण पर beveled किया गया था.
चूषण विंदुक मानक स्तनधारी घंटी समाधान और जमीन इलेक्ट्रोड के साथ भरा इलेक्ट्रोड 1 एक पैच दबाना एम्पलीफायर के GΩ वोल्टेज क्लैंप मोड में (पीसी 501A, वार्नर इंस्ट्रूमेंट्स) headstage जुड़े हुए हैं. एम्पलीफायर (कम से गुजारें 5 kHz पर फ़िल्टर्ड) से अनुरूप संकेत एक डिजिटल आस्टसीलस्कप पर प्रदर्शित करने के लिए वास्तविक समय में संकेत पर नजर रखने के लिए और भी एक 8 पोल Bessel फिल्टर (Krohn-Hite) जहां कम से गुजारें फ़िल्टर्ड संकेत है जुड़े 50 हर्ट्ज पर. दोनों संकेतों (कम 5 kHz और 50 हर्ट्ज पर फ़िल्टर्ड पास) ए / डी कनवर्टर (कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक डिजाइन माइक्रो 1401 mkII) है जो डाटा अधिग्रहण के लिए एक पीसी से जुड़ा है में खिलाया जाता है. डेटा सिग्नल 3 acq का उपयोग कर दर्ज की गई है10 kHz के नमूने आवृत्ति पर uisition सॉफ्टवेयर (कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक डिजाइन). संकेत दो अलग bandwidths में दर्ज की गई है 1 वर्तमान आरोपित कार्रवाई क्षमता के साथ एक साथ रिसेप्टर और फिर वर्तमान अकेले रिसेप्टर (चित्र देखें.) 2 रिकॉर्ड. छिड़काव प्रणाली घंटी (नियंत्रण) समाधान और odorant उत्तेजनाओं या वांछित रचना के किसी भी समाधान के बीच तेजी से स्विच करने के लिए प्रयोग किया जाता है और पीसी और सिग्नल 3 सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित है. समाधान 60 मिलीलीटर सीरिंज में समाहित कर रहे हैं और प्रवाह दर चिकित्सा ग्रेड नसों में प्रवाह नियामकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है. आमतौर पर, प्रवाह दर 1 मिलीग्राम / मिनट के लिए सेट कर दिया जाता है.
रिकॉर्डिंग विंदुक पर चूषण निम्नलिखित तरीके से नियंत्रित किया जाता है: विंदुक धारक की ओर बंदरगाह जो बारी में एक तेल ऊंचाई समायोज्य जलाशय से जुड़ा है एक तेल लाइन से जुड़ा हुआ है. स्थापना या जलाशय कम यह सुनिश्चित करता है कि विंदुक दबाव और पी की नोक के माध्यम से इसलिए घंटी प्रवाहipette न्यूनतम और थोड़ा सकारात्मक है. अतिरिक्त चूषण या दबाव एक जलाशय के हवाई क्षेत्र के लिए एक मुखपत्र के साथ दूसरे छोर पर रिकॉर्डिंग विंदुक टिप में एक अलग ORN के सेल शरीर चूसना जुड़े ट्यूब के माध्यम से लागू किया जा सकता है.
प्रयोगों 37 पर प्रदर्शन कर रहे हैं ° C क्रम में बारीकी से सेल के देशी शारीरिक हालत अनुकरण. तापमान एक हीटिंग कस्टम बनाया इकाई है जो सिरेमिक प्रतिरोधों के माध्यम से जो स्टेनलेस स्टील ट्यूब समाधान युक्त 10 पारित कर रहे हैं के होते हैं के माध्यम से समाधान गुजर द्वारा नियंत्रित है. तापमान निगरानी एक thermocouple थर्मामीटर (अस्थायी) का उपयोग किया जाता है.
2. समाधान
स्तनधारी घंटी (मिमी) समाधान: 140 NaCl, KCl 5, 1 2 MgCl, 2 2 CACL, EDTA 0.01, 10 HEPES, 10 ग्लूकोज. पीएच 7.5 NaOH साथ समायोजित किया गया. एक 10% पतला घंटी समाधान जंक्शन वर्तमान को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. OdoraNT के समाधान: acetophenone और eugenol दैनिक घंटी समाधान में 20 मिमी DMSO स्टॉक से तैयार थे.
3. इलेक्ट्रोड बनाने
- एक unfilamented borosilicate एक Sutter पी 97 micropipette डांड़ी में केशिका गिलास प्लेस और एक लंबे शंकु के साथ एक micropipette खींच.
- Micropipette कस्टम निर्मित एक Nikon E200 ग्रहण खुर्दबीन है जो ऐपिस और एक चल हीरा मंच पर घुड़सवार चाकू में एक लजीला व्यक्ति के साथ फिट बारी में है पर घुड़सवार धारक विंदुक स्थानांतरण.
- 20x उद्देश्य के तहत विंदुक टिप निरीक्षण और लजीला व्यक्ति का उपयोग करने के लिए एक गाइड के रूप में, धीरे मुंशी विंदुक एक 90 ° कोण पर कस्टम निर्मित हीरे चाकू का उपयोग कर जहां विंदुक 10 सुक्ष्ममापी (बाहरी व्यास) चौड़ा है.
- हीरे की चाकू आगे सिरे की ओर ले जाएँ और हीरे की चाकू के साथ नोक पर धीरे - धीरे दबाव लागू. विंदुक टिप सफाई से इस मुद्दे पर जहां यह लिखा गया था पर तोड़ देना चाहिए.
वैकल्पिक रूप से 3.1 करने के लिए कदम3.4 और जोड़ा जा सकता विंदुक टिप में कटौती करने के लिए बिना सीधे pipettes वांछित आयामों के साथ निकाला जा सकता है, हालांकि यह कठिन साबित करने के लिए इस तरह के एक बड़े टिप व्यास और सफाई से कटौती किनारों के साथ मज़बूती से pipettes खींच सकते हैं.
- एक 40x उद्देश्य के तहत, 5 सुक्ष्ममापी की एक विद्युत गरम फिलामेंट का उपयोग एक भीतरी व्यास विंदुक टिप पॉलिश आग. समाप्त होने पर, micropipette माउस ORNs से रिकॉर्डिंग धाराओं के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है. खुला विंदुक प्रतिरोध 1 MΩ के आसपास हो सकता है जब घंटी के साथ भरा जाना चाहिए.
4. घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स के अलगाव
- एक संस्थागत दिशा निर्देशों और नियमों का पालन माउस बलिदान. सिर को हटाने, दूर छील त्वचा खोपड़ी overlying और मध्यवर्ती midline के साथ सिर द्विविभाजित.
- एक विदारक stereomicroscope तहत दो hemi सिर प्लेस, बंद नाक septum खींच और घ्राण turbinates हटा. एक पेट्री डिश में ग्लूकोज ग के साथ सभी ऊतक प्लेसस्तनधारी घंटी समाधान ontaining.
- दो turbinates से अंतर्निहित उपास्थि बंद घ्राण उपकला पील और एक Eppendorf ट्यूब में 250 μl घंटी युक्त ऊतक हस्तांतरण. हम 2 turbinates से ऊतक का उपयोग करने के लिए हमारे रिकॉर्डिंग चैम्बर के आकार के लिए कक्षों की सही घनत्व. 4 ° बाद में उपयोग के लिए सी शेष ऊतक स्टोर.
- भंवर Eppendorf घ्राण उपकला दो बार संक्षिप्त 1 सेकंड के लिए मध्यम गति से युक्त ट्यूब. इस कदम उपकला से ORNs के यांत्रिक हदबंदी के लिए होता है.
- घंटी रिकॉर्डिंग कक्ष में dissociated ORNs युक्त समाधान रखें. ऊतक के बड़े टुकड़े भी निलंबन का उपयोग कर ठीक संदंश में मौजूद निकालें.
- चलो ORNs घंटी के साथ लगातार superfusion शुरुआत से पहले 20 मिनट के लिए बसने और रिकॉर्डिंग करने के लिए आगे बढ़ना है.
5. रिकॉर्डिंग
- चूषण इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग कक्ष और regul में तेल लाइन से जुड़ा लोअरतेल जलाशय की ऊंचाई विंदुक टिप पर थोड़ा सकारात्मक दबाव स्थापित खा लिया. यह जैसे सेल या (सकारात्मक दबाव) की ओर (नकारात्मक दबाव) से विंदुक दूर जाने के मलबे को देख द्वारा किया जा सकता है. सेल मलबे के साथ विंदुक टिप नहीं दूषित करने की कोशिश करो.
- एक अलग ORN जो 20-40x बढ़ाई का उपयोग कर अपने ठेठ द्विध्रुवी आकारिकी द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष स्कैन. ORN सेल शरीर के करीब निकटता में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड ले जाएँ. तो यह है कि सेल शरीर विंदुक टिप में प्रवेश करती है धीरे चूसने शुरू. ध्यान से और धीरे धीरे चूषण लागू जब तक पूरे सेल शरीर चूषण विंदुक टिप में तैयार की है, dendrite और cilia स्नान समाधान को उजागर छोड़ने जारी है. चूसा ORNs और विंदुक आकार की छवियों के लिए 7,11 देखते हैं. सुनिश्चित करें कि एक बार कोई चूषण लागू किया जाता है, ORN में कदम नहीं करता है या विंदुक के बाहर. यदि हां, तो तेल जलाशय की ऊंचाई के हिसाब से समायोजित.
- का प्रयोगके micromanipulators, चैम्बर की रिकॉर्डिंग अनुभाग बसे ORNs वाले अनुभाग से चूषण विंदुक चाल है. समाधान के आदान - प्रदान के लिए 3 बैरल ट्यूब के सामने सावधानी से चूषण विंदुक जगह. चूषण विंदुक 3 बैरल ट्यूब के उद्घाटन के लिए काफी करीब रखा जाना चाहिए ताकि ORN एक लामिना का प्रवाह इस तरह मिश्रण अशांति से बचने के लिए उजागर हो रहा है और तेजी से समाधान विनिमय हासिल. चूषण विंदुक टिप भर में बह समाधान के समानांतर धाराओं के बीच इंटरफेस कदम से समाधान विनिमय हासिल की है. समाधान विनिमय के समय पाठ्यक्रम आमतौर पर लगभग 20 एमएस, जंक्शन सेल अलग ईओण रचना के समाधान के बीच (चित्र देखें 2.) कदम के द्वारा पैदा की वर्तमान से मापा जाता है. समाधान गंभीरता से वितरित कर रहे हैं.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 ए) घ्राण बल्ब में द्विध्रुवी रिसेप्टर न्यूरॉन्स. बी) सिग्नल cilia में पारगमन मशीनरी अंततः वर्तमान बाढ़ उत्तेजक होता है. आगामी विध्रुवण कार्रवाई सेल शरीर में संभावित पीढ़ी से चलाता है.
चित्रा 2 और समाधान विनिमय की गति और विश्वसनीयता को दर्शाता है. 100 एमएस और जंक्शन भिन्न आयन एकाग्रता से उत्पन्न मौजूदा दर्ज किया गया था के लिए एक विंदुक सामान्य से 10% पतला घंटी में कदम रखा था. काले ट्रेस एवेन्यू है5 परीक्षणों के क्रोध, लाल अपने एसडी ट्रेस. समाधान विनिमय के दौरान एसडी में थोड़ा परिवर्तन परीक्षण से परीक्षण और या तो समाधान धारा में अतिरिक्त शोर की कमी के लिए समाधान विनिमय की विश्वसनीयता को दर्शाता है.
चित्रा 3 eugenol प्रेरित चूषण विंदुक तकनीक का उपयोग कर ORN से एक प्रतिक्रिया से पता चलता है. ORN 1 सेकंड के लिए 100 सुक्ष्ममापी eugenol रिकॉर्डिंग ऊपर पट्टी से संकेत के रूप में उजागर किया गया था. अंजीर में. 3A (काले ट्रेस) रिसेप्टर वर्तमान एक 0 बैंडविड्थ पर फ़िल्टर्ड था - 50 हर्ट्ज केवल वर्तमान रिसेप्टर प्रदर्शित चित्र. 5000 हर्ट्ज (लाल ट्रेस) करने के लिए भी कार्रवाई की क्षमता (APs, तीर द्वारा संकेत) प्रदर्शित करने के लिए - 3B ही रिकॉर्डिंग अब 0 के व्यापक बैंडविड्थ पर फ़िल्टर्ड से पता चलता है. इनसेट एक का विस्तार करने के लिए APs प्रतिक्रिया की शुरुआत में और अधिक स्पष्ट रूप से कल्पना timescale में एक ही निशान से पता चलता है.
Eugenol उत्तरदायी ORN चित्रा 4 खुराक प्रतिक्रिया परिवार (एक). Eugenol 0.3 सुक्ष्ममापी से 100 सुक्ष्ममापी लेकर सांद्रता में इस्तेमाल किया गया था, उत्तेजना की अवधि 1 है और निशान पर फ़िल्टर्ड 0 गया - 50 हर्ट्ज. Odorant एकाग्रता में एक प्रगतिशील वृद्धि एक बड़ा और तेजी से प्रतिक्रिया है, जो भी अधिक धीरे धीरे समाप्त हुई एक बार odorant जोखिम समाप्त किया गया नेतृत्व किया.
ORNs मध्यवर्ती odorant सांद्रता (4B छवि) पर लंबी stimulations के दौरान एक oscillatory प्रतिक्रिया स्वरूप प्रदर्शित कर सकते हैं. यहाँ एक acetephenone (3 सुक्ष्ममापी) उत्तरदायी ORN 8 सेकंड के लिए प्रेरित किया गया था. एक तेज और क्षणिक उत्तेजना की शुरुआत में चोटी प्रतिक्रिया छोटे, आवर्ती प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के बाद मनाया जाता है. 50 हर्ट्ज रिकॉर्डिंग बैंडविड्थ 0 गया था.
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Discussion
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम DC009613 एनआईएच, मानव सीमाओं विज्ञान कार्यक्रम और एक मॉर्ले केयर फैलोशिप (जूनियर) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
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