皮层组织和动态可视化的微生物，利用全内反射荧光显微镜
Summary
全内反射荧光显微镜（TIRF）是一个功能强大的方法来观察结构在细胞表面的高对比度和时间分辨率。我们展示的TIRF如何可受聘在皮层细胞壁封闭的细菌和真菌细胞的蛋白质动力学研究。
Abstract
TIRF显微镜已成为一个强大的成像技术，研究时空动态的荧光分子在体外和活细胞1。全内反射光的现象时有发生，当光线从高折射率介质传递到与低折射率介质在一个角度大于特征的临界角（即接近边界平行）。尽管所有的光被反射回在这种情况下，创建渐逝波传播横跨和沿边界，距离指数衰减，只有穿透样本地区是100-200纳米界面附近的2。除了 提供优越的轴向分辨率，减少了重点荧光激发创建了一个非常高的信号噪声比和减少漂白2,3破坏性影响。作为一个广角技术的TIRF还允许更快的图像交流quisition比扫描基于共聚焦设置。
乍一看，低的TIRF穿透深度，似乎是不符合，这往往是厚厚的细胞壁所包围的细菌和真菌细胞成像。相反，我们发现，酵母和细菌细胞的细胞壁，实际上提高可用性的TIRF和增加4-8观察到的结构范围内。许多细胞过程，因此可以直接访问的TIRF小，单细胞微生物，它往往提供了强有力的遗传操作技术。这使我们能够执行在体内的生化实验，可以直接在活细胞中进行评估蛋白质相互作用和活动的动力学。
在这里，我们描述了酵母或枯草芽孢杆菌细胞获得高品质的TIRF图像所需的各个步骤。我们指出的各种问题，可以affeCT的TIRF可视化细胞中的荧光探针和几个应用实例说明过程。最后，我们展示的TIRF图像可进一步提高使用既定的图像恢复技术。
Protocol
Discussion
TIRF显微镜图像周边蛋白的首选技术。渐逝场的低渗透深度，最大限度地减少了光的焦点，这导致了一个非常好的信噪比，并允许数据采集，高帧频，或非常弱表达的蛋白质成像。高对比度和高帧率相结合，使TIRF显微镜的成像时空外皮本地化的蛋白质动力学的完美的工具。有趣的是，厚厚的细胞壁周围的许多微生物不妨碍周边蛋白的TIRF成像。事实上，渐逝的实际发电量很可能发生在细胞壁和细胞…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由马克斯 – 普朗克协会。
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
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