Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy
Summary
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, um Strukturen in der Nähe der Zelloberfläche bei hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung zu beobachten. Wir zeigen, wie TIRF eingesetzt werden können, um Protein-Dynamik in der Rinde der Zellwand-geschlossenen Zellen von Bakterien und Pilzen zu studieren.
Abstract
TIRF-Mikroskopie hat sich als leistungsfähige Imaging-Technologie, um raum-zeitliche Dynamik der fluoreszierenden Moleküle in vitro zu untersuchen und in lebenden Zellen 1 entstanden. Die optische Erscheinung der Totalreflexion auftritt, wenn Licht von einem Medium mit hohem Brechungsindex zu einem Medium mit niedrigem Brechungsindex unter einem Winkel größer als eine charakteristische kritische Winkel (dh näher an parallelen wobei mit der Grenze). Obwohl alle Licht wird unter solchen Bedingungen widerspiegelt, wird eine abklingende Welle erzeugt, breitet sich über und entlang der Grenze, die mit Abstand exponentiell abklingt, und dringt nur Bereiche, die Probe 100-200 nm in der Nähe der Schnittstelle 2 sind. Neben der Bereitstellung überlegener axiale Auflösung, erstellt der reduzierten Anregung aus dem Fokus Fluorophore ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis und minimiert schädliche Auswirkungen von Photobleaching 2,3. Als Weitfeld-Technik, TIRF erlaubt auch schnellere Bild acErwerb als die meisten Scan-basierte konfokale Setups.
Auf den ersten Blick scheint die geringe Eindringtiefe der TIRF für unvereinbar mit Bildgebung von Zellen von Bakterien und Pilzen, die häufig mit dicken Zellwänden umgeben sind. Im Gegenteil haben wir festgestellt, dass die Zellwände von Hefe-und Bakterienzellen tatsächlich verbessern die Nutzbarkeit von TIRF und erhöhen die Reichweite von beobachtbaren Strukturen 4-8. Viele zelluläre Prozesse können somit direkt von TIRF werden in kleine, einzellige Mikroorganismen, die häufig bieten starke genetische Manipulation Techniken abgerufen. Dies ermöglicht uns, In-vivo-Experimente Biochemie, wo Kinetik von Protein-Interaktionen und Aktivitäten, die direkt in lebenden Zellen beurteilt werden durchführen können.
Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte erforderlich, um qualitativ hochwertige Bilder für TIRF Saccharomyces cerevisiae oder Bacillus subtilis-Zellen zu erhalten. Wir weisen darauf hin verschiedene Probleme, die kann affect TIRF Visualisierung von fluoreszierenden Sonden in Zellen und illustrieren das Verfahren mit mehreren Anwendungsbeispielen. Schließlich zeigen wir, wie TIRF Bilder weiter verbessert werden kann mit etablierten Techniken Bildrestaurierung.
Protocol
Discussion
TIRF-Mikroskopie ist die Technik der Wahl, um Bild peripheren Proteinen. Die geringe Eindringtiefe der abklingenden Feldes minimiert von außerhalb des Fokus Licht, das zu einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis führt und ermöglicht die Datenerfassung mit hoher Frame-Raten, oder Abbildung von sehr schwach exprimierte Proteine. Die Kombination aus hohem Kontrast und hoher Bildraten TIRF-Mikroskopie macht ein perfektes Werkzeug für die Abbildung raum-zeitliche Dynamik von kortikal lokalisierte Proteine. Interessante…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft finanziert.
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
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