La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna
Summary
Reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía es un enfoque poderoso para observar las estructuras cerca de la superficie celular en alto contraste y resolución temporal. Se demuestra cómo TIRF puede ser empleado para estudiar la dinámica de proteínas en la corteza de la pared celular-cerrados células bacterianas y fúngicas.
Abstract
Microscopía TIRF se ha convertido en una tecnología de imagen de gran alcance para estudiar dinámica espacio-temporal de las moléculas fluorescentes in vitro y en células vivas 1. El fenómeno óptico de reflexión interna total ocurre cuando la luz pasa de un medio con alto índice de refracción en un medio con bajo índice de refracción en un ángulo mayor que un ángulo característica crítica (es decir, más cerca de ser paralelo con el límite). Aunque toda la luz se refleja de nuevo bajo tales condiciones, una onda evanescente se crea que se propaga a través ya lo largo del límite, que decae exponencialmente con la distancia, y sólo penetra áreas de la muestra que son 100-200 nm cerca de la interfaz 2. Además de proporcionar resolución axial superior, la excitación reducida de fuera de fluoróforos focales crea una señal de muy alta a ruido y minimiza los efectos perjudiciales de photobleaching 2,3. Al ser una técnica de campo amplio, TIRF también permite que la imagen más rápido de corriente alternaquisition que la mayoría de exploración basados en configuraciones confocal.
A primera vista, la profundidad de penetración bajo TIRF parece ser incompatible con la imagen de las células bacterianas y de hongos, que a menudo rodeadas de paredes celulares gruesas. Por el contrario, hemos encontrado que las paredes celulares de levadura y células bacterianas en realidad mejorar la facilidad de uso de TIRF y aumentar la gama de estructuras observables 4-8. Muchos procesos celulares por lo tanto, se puede acceder directamente por la TIRF en pequeños microorganismos unicelulares, que a menudo ofrecen poderosas técnicas de manipulación genética. Esto nos permite llevar a cabo en los experimentos de bioquímica in vivo, donde la cinética de las interacciones de las proteínas y las actividades se puede evaluar directamente en las células vivas.
Se describe aquí los pasos individuales necesarios para obtener imágenes de alta calidad para TIRF Saccharomyces cerevisiae o células de Bacillus subtilis. Se señala varios problemas que pueden Affect TIRF visualización de sondas fluorescentes en las células e ilustrar el procedimiento con varios ejemplos de aplicación. Por último, se demuestra cómo las imágenes TIRF se puede mejorar usando técnicas de restauración de imagen establecidos.
Protocol
Discussion
Microscopía TIRF es la técnica de elección para las proteínas de la imagen periféricos. La profundidad de penetración baja del campo evanescente minimiza de fuera de foco de luz, lo que conduce a una señal de muy buena a ruido y permite la adquisición de datos con altas velocidades de fotogramas o imágenes de las proteínas expresadas muy débilmente. La combinación de alto contraste y alta velocidad de fotogramas hace de la microscopía TIRF una herramienta perfecta para imagen dinámica espacio-temporal de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Sociedad Max Planck.
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
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