Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection
Summary
Total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) é uma abordagem poderosa para observar as estruturas perto da superfície da célula em alto contraste e resolução temporal. Demonstramos como TIRF pode ser empregue para estudar a dinâmica de proteína no córtex de parede celular fechados células bacterianas e fúngicas.
Abstract
Microscopia TIRF emergiu como uma tecnologia de imagem poderosa para estudar espácio-temporais dinâmica de moléculas fluorescentes in vitro e em células vivas 1. O fenómeno óptico de reflexão interna total ocorre quando a luz passa de um meio com elevado índice de refracção em um meio com baixo índice de refracção com um ângulo maior do que um ângulo característica crítica (isto é, mais perto de ser paralelo com o limite). Embora toda a luz é reflectida de volta sob tais condições, uma onda evanescente é criado que se propaga através e ao longo do limite, que decai exponencialmente com a distância, e só penetra áreas de amostra que são 100-200 nm perto da interface 2. Além de proporcionar resolução axial superior, a excitação reduzida de fora do foco fluoróforos cria um sinal muito alta para relações de ruído e minimiza os efeitos prejudiciais da fotodegradação 2,3. Sendo uma técnica de campo amplo, TIRF também permite que imagem mais rápido acquisition do que a maioria de digitalização baseados em configurações confocal.
À primeira vista, a profundidade de penetração baixa de TIRF parece ser incompatível com a imagem de células bacterianas e fúngicas, que são muitas vezes cercados por paredes celulares espessas. Pelo contrário, verificou-se que as paredes celulares de levedura e células bacterianas realmente melhorar a usabilidade do TIRF e aumentar a gama de estruturas observáveis 4-8. Muitos processos celulares podem ser acessados diretamente pelo TIRF em pequenos microorganismos unicelulares, que muitas vezes oferecem poderosas técnicas de manipulação genética. Isso nos permite executar em experimentos de bioquímica in vivo, onde cinética de interações protéicas e atividades podem ser avaliados diretamente em células vivas.
Descrevemos aqui os passos individuais necessárias para obter imagens de alta qualidade para TIRF Saccharomyces cerevisiae ou células de Bacillus subtilis. Ressalte-se vários problemas que podem Affect visualização TIRF de sondas fluorescentes em células e ilustram o procedimento com vários exemplos de aplicação. Por fim, demonstramos como as imagens TIRF pode ser melhorada usando técnicas de restauração de imagem estabelecidos.
Protocol
Discussion
Microscopia TIRF é a técnica de escolha para as proteínas de imagem periféricos. A profundidade de penetração de baixo do campo evanescente minimiza de fora do foco de luz, o que leva a um sinal muito bom para relação de ruído e permite que a aquisição de dados com altas taxas de quadros de imagem, ou de proteínas muito fracamente expressas. A combinação de alto contraste e altas taxas de quadros faz TIRF microscopia uma ferramenta perfeita para imagens espaço-temporais dinâmica de proteínas corticalmen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck.
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
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