Visualisering af Cortex Organisation og Dynamics i mikroorganismer, ved hjælp af total indre refleksion Fluorescens Mikroskopi
Summary
Total indre refleksion Fluorescens (TIRF) mikroskopi er en kraftfuld fremgangsmåde til at observere strukturer tæt på celleoverfladen ved høj kontrast og tidsmæssig opløsning. Vi viser, hvordan TIRF kan anvendes til at studere protein dynamik ved cortex af cellevæg-lukkede bakterielle og fungale celler.
Abstract
TIRF mikroskopi har vist sig som en stærk imaging-teknologi til at studere spatio-temporale dynamik i fluorescerende molekyler in vitro og i levende celler 1. Det optiske fænomen af total indre refleksion finder sted, når lys passerer fra et medium med højt brydningsindeks til et medium med lavt brydningsindeks i en vinkel større end en karakteristisk kritisk vinkel (dvs. tættere på at være parallel med grænsen). Selv om alle lys reflekteres tilbage under sådanne forhold, er en kortvarig bølge skabt, udbreder på tværs og langs grænsen, der henfalder eksponentielt med afstanden, og kun trænger prøve områder, der er 100-200 nm nær grænsefladen 2. Ud over at tilvejebringe fremragende aksial opløsning, skaber den reducerede excitation af ude af fokus fluoroforer meget højt signal-støj-forhold og minimerer skadelige virkninger af fotoblegning 2,3. Være en widefield teknik, TIRF også mulighed for hurtigere billedbehandling acKøbet end de fleste scanning baserede konfokal opsætninger.
Ved første øjekast synes lav dækningsgrad dybde TIRF at være uforenelig med scanning af bakterie-og svampe celler, der ofte omgivet af tykke cellevægge. Tværtimod har det vist sig, at cellevæggene af gær-og bakterieceller faktisk forbedre anvendeligheden af TIRF og øge antallet af observerbare strukturer 4-8. Mange cellulære processer kan derfor direkte adgang TIRF i små encellede mikroorganismer, som ofte giver stærke genetiske manipuleringsteknikker. Det giver os mulighed for at udføre in vivo biokemiske forsøg, hvor kinetikken af protein interaktioner og aktiviteter, der direkte kan vurderes i levende celler.
Vi beskriver her de enkelte trin er nødvendige for at opnå en høj kvalitet TIRF billeder i Saccharomyces cerevisiae eller Bacillus subtilis celler. Vi gør opmærksom på forskellige problemer, der kan affect TIRF visualisering af fluorescerende prober i celler og illustrerer proceduren med flere eksempler på anvendelser. Endelig har vi vise, hvordan TIRF billeder kan forbedres yderligere ved anvendelse af etablerede billede restaurering teknikker.
Protocol
Discussion
TIRF mikroskopi er den teknik, valg til billede perifere proteiner. Den lave indtrængningsdybden af udklingende felt minimerer ude af fokus lys, hvilket fører til et meget godt signal-støj-forholdet og tillader dataopsamling med høje rammehastigheder eller billeddannende meget svagt udtrykte proteiner. Kombinationen af høj kontrast og høj frame rates gør TIRF mikroskopi et perfekt værktøj til billedbehandling spatio-temporale dynamik cortically lokaliserede proteiner. Interessant den tykke cellevæg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Max Planck samfundet.
Materials
| Name of the tool/reagent | Type | Company | Catalogue number |
| Orbital Shaker | Tool | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER |
| TIRF microscope | Till | Customized setup | |
| Glass container | Tool | Vitlab | 340-232880353 |
| Ceramic staining rack | Tool | Thomas Sci. | 8542E40 |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | L7647 |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Microscope | Menzel Gläser | BB018018A1 |
| Microscope Slides | Microscope | Menzel Gläser | AA00000102E |
| Immersion Oil | Microscope | Zeiss | Immersol 518F |
| Agarose | Reagent | Invitrogen | 16500-500 |
| FluoSpheres | Reagent | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
