Retrograde Laden van zenuwen, Tracts, en Spinal Roots met fluorescente kleurstoffen
Summary
Wij beschrijven een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen hoge concentratie van fluorescerende en calcium-gevoelige kleurstoffen in neuronen of neuronale kanaal met een polyethyleen zuig pipet.
Abstract
Retrograde etikettering van neuronen is een standaard anatomische methode 1,2 die ook is gebruikt om calcium-en voltage-sensitieve kleurstoffen te laden in neuronen 3-6. Over het algemeen worden de kleurstoffen toegepast als vaste kristallen, of door lokale druk injectie met glazen pipetten. Dit kan echter leiden tot een verdunning van de kleurstof en een verminderde intensiteit van de etikettering, in het bijzonder wanneer meerdere uren nodig zijn voor kleurstofdiffusie. Hier tonen een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen fluorescentie en ion-gevoelige kleurstoffen in neuronen met een polyethyleen zuig pipet gevuld met de kleurstofoplossing. Deze methode biedt een betrouwbare wijze voor handhaving van een hoge concentratie van de kleurstof in contact met axons gedurende het laden.
Protocol
Fluorescerende dextranen zijn gebruikt als anatomische gereedschappen en voor het afbeelden van neuronale activiteit 1-4. Velden et al.., (2009) 4 publiceerde een protocol voor het toepassen van ionen-en voltage-sensitieve kleurstoffen om axonale stukken met een focus op het ruggenmerg als modelsysteem. Hier beschrijven we een meer gedetailleerde procedure voor de toepassing van TL-en / of ion-gevoelige kleurstof om de snede ventrale wortels, dorsale wortels of een neuronale kanaal van het…
Discussion
<p class="jove_content"> We beschrijven hier een eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor de invoering van kleurstoffen in de neuronen, de zenuwen en spinale traktaten. Deze methode omvat het blootstellen geïdentificeerd anatomische trajecten een zeer geconcentreerde kleurstof oplossing voor de duur van het laden. Dit resulteert in een retrograde etikettering van de target site met weinig achtergrond in vergelijking met micro-injecties, bad toepassing en elektroporatie technieken. Echter, de werkwijze beperkt tot sites in het zenuwstels…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Dit werk werd ondersteund door de intramurale programma van de National Institutes of Neurologische Aandoeningen en Stroke in de National Institutes of Health. Wij zouden ook graag Dr George Mentis bedanken voor zijn eerdere bijdragen aan de methode en de gegevens in figuur 3.</p
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments | |
| Tubing | PE90 (IDxOD:0.034″x0.050″; Wall Thikness:0.008″) | Clay Adams Brand Intermedic | 427421 | For Type I & Type II pipettes |
| NSF-51(IDxOD:1/16×1/8; Wall Thikness:1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | For Flexible tubing | |
| Syringe | 1ml insulin Syringe U-100 | Becton Dickenson | 329650 | |
| Needle | 19G x1-1/2″ Metal Hub Needle | MONOJECT | 200136 | Connecting Type II pipette to syringe |
| Alcohol Lamp | ||||
| Stopcock | Three-way Stopcock with Male Luer Slip Adapter | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Use with syringe |
| Holder | H-1 electrode holder | Narishige | H-1/12 | |
| Magnet stand | Narishige | GJ-8 | ||
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | ||
| Tweezers | S&T DUMONT Swiss 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC | |
*Those are suggested materials. Can be replaced with any compatible products
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O’Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O’Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
- O’Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O’Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O’Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O’Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O’Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
Cite This Article
Blivis, D., O’Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).