Retrograde Loading von Nerven, Tracts, und Spinalwurzeln mit Fluoreszenzfarbstoffen
Summary
Wir beschreiben ein einfaches und kostengünstiges Verfahren zum Einführen hohe Konzentration von fluoreszierenden und Calcium-sensitiven Farbstoffen in Neuronen oder neuronaler ein Polyethylen Saugpipette.
Abstract
Retrograde Markierung von Neuronen ist ein Standard anatomische Methode, die auch 1,2 verwendet wurde, um Calcium und spannungsabhängigen Farbstoffen in Neuronen 3-6 geladen. Im Allgemeinen werden die Farbstoffe als feste Kristalle oder durch lokale Injektion mit Druck Glaspipetten aufgebracht. Dies kann jedoch zu einer Verdünnung des Farbstoffs und vermindertem Markierungsintensität führen, insbesondere wenn mehrere Stunden Farbstoffdiffusion erforderlich sind. Hier zeigen wir eine einfache und kostengünstige Technik zur Einführung fluoreszierenden und Ionen-sensitiven Farbstoffen in Neuronen ein Polyethylen Saugpipette mit dem Farbstoff-Lösung gefüllt. Dieses Verfahren bietet eine zuverlässige Möglichkeit zur Aufrechterhaltung einer hohen Konzentration des Farbstoffs in Kontakt mit Axone in der Ladevorgang.
Protocol
Fluoreszierende Dextrane wurden als anatomische Werkzeuge und für die Bildgebung neuronaler Aktivität 4.1 verwendet wurde. Fields et al., (2009) 4 veröffentlichte ein Protokoll für die Anwendung von Ionen-und spannungsabhängigen Farbstoffen zu axonalen Bahnen mit einem Fokus auf das Rückenmark als Modellsystem. Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren für die Anwendung fluoreszierender und / oder Ionen-sensitiven Farbstoffs an den Schnittflächen ventralen Wurzeln, dorsalen …
Discussion
<p class="jove_content"> Wir beschreiben hier eine einfache und kostengünstige Protokoll zur Einführung von Farbstoffen in Neuronen, Nerven und Rückenmarksbahnen. Dieses Verfahren schließt ein, dass identifizierten anatomischen Pfade einem hoch konzentrierten Farbstofflösung für die Dauer des Ladevorgangs. Dies führt zu retrograde Markierung der Ziel-Site mit wenig Hintergrund zu Mikroinjektionen, Bad und Anwendung der Elektroporation Techniken verglichen. Jedoch ist das Verfahren auf Seiten des Nervensystems, wo eine Strecke von Axon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Diese Arbeit wurde von der intramuralen Programm des National Institute of Neurological Disorders and Stroke in der National Institutes of Health unterstützt. Wir möchten auch an Dr. George Mentis für seine früheren Beiträge zur Methode und zu den Daten in Abbildung 3 zu danken.</p
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments | |
| Tubing | PE90 (IDxOD:0.034″x0.050″; Wall Thikness:0.008″) | Clay Adams Brand Intermedic | 427421 | For Type I & Type II pipettes |
| NSF-51(IDxOD:1/16×1/8; Wall Thikness:1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | For Flexible tubing | |
| Syringe | 1ml insulin Syringe U-100 | Becton Dickenson | 329650 | |
| Needle | 19G x1-1/2″ Metal Hub Needle | MONOJECT | 200136 | Connecting Type II pipette to syringe |
| Alcohol Lamp | ||||
| Stopcock | Three-way Stopcock with Male Luer Slip Adapter | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Use with syringe |
| Holder | H-1 electrode holder | Narishige | H-1/12 | |
| Magnet stand | Narishige | GJ-8 | ||
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | ||
| Tweezers | S&T DUMONT Swiss 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC | |
*Those are suggested materials. Can be replaced with any compatible products
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O’Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O’Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
- O’Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O’Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O’Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O’Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O’Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
Cite This Article
Blivis, D., O’Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).