Retrograd Lastning av nerver, skrifter och spinalrötterna med fluorescerande färgämnen
Summary
Vi beskriver en enkel och billig teknik för att införa höga koncentrationen av fluorescerande och kalcium-känsligt färgämnen till neuroner eller någon neuronala tract användning av en pipett polyeten sugning.
Abstract
Retrograd märkning av neuroner är en vanlig metod anatomisk 1,2 som också har använts för att lasta kalcium och spänningskänsliga färgämnen till neuroner 3-6. I allmänhet är de färgämnen som används fasta kristaller eller genom lokal injektion tryck med användning av glaspipetter. Emellertid kan detta resultera i utspädning av färgämnet och reducerad märkning intensitet, särskilt när flera timmar krävs för att färgdiffusion. Här visar vi en enkel och billig teknik för att införa fluorescerande och jon-känsliga färgämnen till neuroner som använder en pipett polyeten sugning fylld med färglösningen. Denna metod erbjuder ett pålitligt sätt för att upprätthålla en hög koncentration av färgämnet är i kontakt med axoner hela laddningsproceduren.
Protocol
Fluorescerande dextraner har använts som anatomiska verktyg och för avbildning nervaktivitet 1-4. Fields et al, (2009) 4 publicerade ett protokoll för tillämpning av jon-och spänningskänsliga färgämnen för att axonala trakter med fokus på ryggmärgen som modellsystem. Här beskriver vi ett mer detaljerat förfarande för tillämpning av fluorescerande och / eller jon-känslig färg på de skurna ventrala rötterna, bröst rötter eller någon neuronala område av ryggmärgen för…
Discussion
<p class="jove_content"> Vi beskriver här en enkel och kostnadseffektiv protokoll för att införa färgämnen i nervceller, nerver och spinala skrifter. Denna metod är att exponera identifierade anatomiska vägar till en mycket koncentrerad färglösning under hela laddningen processen. Detta resulterar i retrograd märkning av målområdet med lite bakgrundsinformation jämfört med mikroinjektion och bad ansökan och tekniker elektroporation. Emellertid är metoden begränsad till ställen i nervsystemet, där ett område av axoner kan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Detta arbete stöddes av intramural program National Institutes of Neurological Disorders and Stroke vid National Institutes of Health. Vi vill också tacka Dr George Mentis för sina tidigare bidrag till den metod och de uppgifter som i figur 3.</p
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments | |
| Tubing | PE90 (IDxOD:0.034″x0.050″; Wall Thikness:0.008″) | Clay Adams Brand Intermedic | 427421 | For Type I & Type II pipettes |
| NSF-51(IDxOD:1/16×1/8; Wall Thikness:1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | For Flexible tubing | |
| Syringe | 1ml insulin Syringe U-100 | Becton Dickenson | 329650 | |
| Needle | 19G x1-1/2″ Metal Hub Needle | MONOJECT | 200136 | Connecting Type II pipette to syringe |
| Alcohol Lamp | ||||
| Stopcock | Three-way Stopcock with Male Luer Slip Adapter | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Use with syringe |
| Holder | H-1 electrode holder | Narishige | H-1/12 | |
| Magnet stand | Narishige | GJ-8 | ||
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | ||
| Tweezers | S&T DUMONT Swiss 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC | |
*Those are suggested materials. Can be replaced with any compatible products
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O’Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O’Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
- O’Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O’Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O’Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O’Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O’Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
Cite This Article
Blivis, D., O’Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).