Summary
Vi beskriver en ny metod för att isolera genomiskt DNA från helblod för plasma / serologi. Efter plasma, är den komprimerade blod brukar kasseras. Vår nya metod innebär en betydande förbättring jämfört med befintliga metoder och gör DNA och plasma tillgängliga från en enda samling, utan att begära ytterligare blod.
Abstract
Laboratorietester kan göras på de cellulära eller flytande delar av blodet. Användningen av olika blodprovsrör bestämmer delen av blodet som kan analyseras (helblod, plasma eller serum). Laboratorier som deltar i att studera den genetiska grunden för mänskliga sjukdomar är beroende av antikoagulerat helblod i EDTA-innehållande vacutainer som källa för DNA för genetisk / genomisk analys. Eftersom de flesta kliniska laboratorier utför biokemiska, serologiska och virala testresultat som ett första steg i fenotypisk utfall undersökningen, antikoagulerat blod också samlats i heparin-innehållande rör (plasma tube). Därför när DNA och plasma behövs för samtidiga och parallella analyser av både genetiska och proteomik data är det brukligt att samla in blod i både EDTA och heparin rör. Om blod skulle kunna samlas i ett enda rör och fungera som en källa för både plasma och DNA, skulle denna metod betraktas som en förbättring av befintliga methods. Användningen av den kompakterade blod efter plasmaextraktion utgör en alternativ källa för genomiskt DNA, vilket minimerar den mängd blod som bearbetade proverna och minska antalet sampel som krävs av varje patient. Detta skulle slutligen spara tid och resurser.
BD P100 bloduppsamlingssystem för plasmaprotein bevarande skapades som en förbättrad metod än tidigare plasma eller serum samling rören 1, för att stabilisera proteinhalten i blodet, vilket möjliggör bättre upptäckt protein biomarkör och proteomik experiment från humant blod. BD P100 rör innehåller 15,8 ml spraytorkad K2EDTA och en lyofiliserad proprietary brett spektrum cocktail av proteasinhibitorer för att förhindra koagulering och stabilisera plasmaproteiner. De har också en mekanisk separator, vilket ger en fysisk barriär mellan plasma och pellets cell efter centrifugering. Få metoder har anvisats för att extrahera DNA från koagulerat blod SAmples samlats i gamla plasma rören 2-4. Utmaningar från dessa metoder var i huvudsak är knuten till typen av separator inuti rören (gel separator) och inkluderade svårighet att återvinna den levrat blod, besväret att fragmentera eller dispergera koaglet, och obstruktion av koagel extraktion genom separationsgelen.
Vi presenterar den första metoden som utvinner och renar genomisk DNA från blod dras i de nya BD P100 rör. Vi jämför kvaliteten på DNA-prov från P100 rören till att från EDTA-rör. Vår strategi är enkel och effektiv. Det handlar om fyra viktiga steg enligt följande: 1) användning av en plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) rör med mekanisk separator för provtagningen, 2) avlägsnande av den mekaniska separatorn använder en kombination av sackaros och en steril gem metallisk krok, 3) separation av lättcellskoncentratskiktet innehållande de vita cellerna och 4) isolering av genom-DNA frånbuffy coat med en vanlig kommersiell kit DNA-extraktion eller liknande standardprotokoll.
Protocol
Ett. Provtagning
- Samla blodprov från individer med korrekt informerat samtycke. För varje individ, rita 4 till 5 ml blod i ett P100 rör (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). För jämförelsens skull, samtidigt samla blod i ett EDTA-rör.
- BD P100 rör innehåller 15,8 ml spraytorkat K2EDTA och en lyofiliserad proprietary brett spektrum cocktail av proteasinhibitorer för att förhindra koagulering och stabilisera plasmaproteiner. De innehåller också en mekanisk separator. Efter uppsamling av helblod, hålla båda rören vid rumstemperatur under 60 min till över natten tills bearbetningen görs.
- Centrifugera BD P100 rören vid 2500 g under femton minuter vid rumstemperatur. Överför plasma som samlats ovanför den mekaniska separatorn i mikro centrifugrör.
- Förvara P100 rören, innehållande blodet pressas nedanför separatorn, vid -80 ° C tills du är redo att börja DNA extdiffraktion.
2.1 Från blod P100 röret (P100_DNA)
- De P100 Rören lagras vid -80 ° C efter plasmaextraktion. Inom 3 till 4 månader, hämta P100 rör innehållande den kompakterade blod från frysen och tina i 37 ° i ett vattenbad under 5 min (Figur 1A). Ta bort resterande plasma som sitter ovanför separatorn. Tillsätt 2 ml av 17% sackaroslösning (gradientlösningen testas i huset - opublicerade data) i P100 rören ovanför separatorn (Figur 1B). Centrifugera rören vid rumstemperatur under 20 min vid 2500 g, denna process pressar den mekaniska separatorn till toppen av röret och ger tre skikt av lösningen innefattande den buffy coat (figur 1C). Manuellt extrahera separatorn med hjälp av en steriled hakad metall gem (figur 1D).
- När du har hämtat den mekaniska separatorn från varje rör (figur 1D), ta bort och discard det övre sackaros skiktet. Överför mellanskiktet, representerande lättcellskoncentratet (BC) skikt, i en steril 15 ml koniska rör. Lägg Saline fosfatbuffert (PBS) för att öka den gula hinnan volymen till 3 ml. Extrahera DNA från buffy coat med användning av reagens från Qiagen Puregene Blood Kit enligt tillverkarens rekommendation, utom en centrifugeringshastighet av 2500 g (istället för 2000 g).
- För att lysera och ta bort de röda blodkropparna (RBC), tillsätt 9 ml RBC-lys till 3 ml buffy coat. Invertera varje rör flera gånger och inkubera vid rumstemperatur under 10 min med tillfällig inverterande under inkubation. Snurra varje blandning nere vid 2500 g under 5 min och kassera supernatanten. Behandla den återstående pelleten i varje rör med 3 ml av cell-lys-lösning och vortexa i 15 sek. Behandla lysatet med 1 ml protein fällningslösningen och vortexa i 15 sek.
- Centrifugera vid 2500 g under 5 min och överför supernatanten till ett nytt 15 ml koniskt rör innehållande3 ml 100% isopropanol. Invertera de nya rören 10 gånger och centrifugera vid 2500 g under 3 min. Kasta bort supernatanten och tillsätt 1 ml 70% etanol. Vänd de koniska rör ett par gånger för att få bort och tvätta DNA pelleten. Centrifugera vid 2500 g under 1 min. Låt pelleten torka i 3 min (placera röret upp och ned) vid rumstemperatur och sedan avbryta DNA med 250 ml rehydrering lösning vid 37 ° C under 10 min och överföring till en pre-märkt 1,7 ml mikrorör. Förvara rören vid -80 ° C fram till användning.
2,2 från blod i EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- Hela blod för rutinmässig immunhematologi testning uppsamlas i plast vaccutainer tuber spraybelades med 10,8 mg av K 2 EDTA och lagrades vid -80 ° C. Eftersom rören inte innehåller en mekanisk separator, innehåller DNA-extraktion inte de steg som omfattar den mekaniska separatorn (2.1.1 och 2.1.2).
- Inom 3 till 4 månader av blod lagring, DNA extraheras med Kingfisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Det är en automatisering DNA-extraktion som bygger på magnetisk partikel-teknik och består av cellysering / DNA-bindande, flera tvättningssteg och DNA elueringsprofiler.
- Satsen används i DNA-extraktion är KingFisher Flex 24 DNA Blood Kit (Qiagen, Tyskland).
Tre. DNA kvantitet och kvalitet Assessment
Den kvantitet, kvalitet och integritet genom-DNA bedömdes av en kombination av metod som inkluderar PicoGreen, spektroskopi och elektrofores.
- Koncentrationen av det genomiska DNA bestäms genom Nanodrop och PicoGreen kvantifiering.
- Renheten bestäms från 260/280 med mätning på Nanodrop spektrofotometer.
- Provet (500 ng) är också laddad på 1% agarosgel för att bedöma integriteten (nedbrytning) av DNA.
4. Genotyping Analyser och kvalitetskontroll
- Fem P100_DNA och deras motsvarande prover EDTA_DNA är slumpmässigt utvalda för vidare analys med hjälp av anpassade Immunochip (Immuno DNA Analysis BeadChip). Immunochip är en Infinium genotypning chip som innehåller 196.524 polymorfismer och är utformad för immunogenetiska studier 5.
- För varje prov, är 200 ng DNA amplifieras, fragmenterade, utfälldes och återsuspenderades i lämplig hybridiseringsbuffert.
- De denaturerade prover hybridiseras på Immunochips vid 48 ° C under minst 16 timmar.
- Efter hybridisering Immunochips behandlas för singel-bas förlängningsreaktioner och färgas.
- De immunochips därefter avbildas med Illumina Hiscan Bead array läsare och de normaliserade bead intensitetsdata laddas in i Illumina GenomeStudio programvara och omvandlas till genotyper. Genotyper kallas med autocalling algoritm GenomeStudio. Den kvalitetskontroll ivolves uteslutning av enstaka (SNPs) med en uttagssats <95%.
- SNP uttagssatsen används som ett mått på immunochip analysen effektivitet. Det beräknas som andel av det totala antalet analyser på chippet (196.524 SNPs kodas på varje chip) som uppnår tillräcklig signalstyrka och kvalitet för att få en automatiserad genotyp uppdrag. Hög kvalitet DNA (260/280 förhållande av 1,8 eller högre och frånvaro av nedbrytning) förväntas uppnå minst samma samtal takt som HapMap kontroll-DNA ingår i immunochip analysen. Kvalitetskontroll innebär uteslutning av SNP med en uttagssats <95% i varje datamängd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA kvalitetsbedömning och koncentration mätning
Utbytena av P100_DNAs var betydligt lägre än de för EDTA_DNAs (tabellerna 1 och 2). Den DNA-renheten företrädd av sin 260/280 kvotvärde är likartad för både P100_DNA och EDTA_DNA prov set (tabellerna 1 och 2). Kvaliteten på DNA är tämligen likformig inom varje uppsättning av prov även om viss försämring ses i de EDTA_DNA proverna, såsom indikeras av lätt påstrykning (figur 2). De EDTA_DNAs som visade mer tecken på nedbrytning visade också minskad DNA-koncentration.
Genotypning
Genotypning sats för både EDTA_DNAs och P100_DNAs jämfördes. De gav liknande samtalspriser och var båda jämförbara med den interna HapMap kontroll-DNA (tabell 3).
Figur 1. Buffy coat isolering.
Tabell 1. DNA-prov avkastning (PicoGreen) och ratio (NanoDrop).
| DNA Utbyte | DNA Renhet | |||
| Prover | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1,79 | 1,9 |
| 2 | 119 | 344 | 1,85 | 1,89 |
| 3 | 57 | 129 | 1,88 | 1,88 |
| 4 | 159 | 640 | 1,86 | 1,88 |
| 5 | 140 | 430 | 1,86 | 1,88 |
| 6 | 150 | 673 | 1,86 | 1,9 |
| 7 | 139 | 425 | 1,74 | 1,88 |
| 8 | 118 | 240 | 1,87 | 1,86 |
| 9 | 51 | 86 | 1,87 | 1,83 |
| p-värde | p = 0,00221 | p = 0,09836 | ||
Tabell 2. Jämförelse av utbyte och renhet (tvåsidigt, Parat Sample t-test).
| Genotypning Cell Rate | ||
| Prover | P100 | EDTA |
| 1 | 97,9 | 97,5 |
| 2 | 97,9 | 97,8 |
| 4 | 97,4 | 97,5 |
| 7 | 97,5 | 98,2 |
| 8 | 97,9 | 98 |
| P-värde | p = 0,67970 | |
Tabell 3. Genotypning samtalstaxa (tvåsidigt, Parat Sample t-test).
| Prover | Skikt | Utbyte (^ ig) | Förhållande (260/280) |
| Buffy coat | 150 | 1,86 | |
| RBC | 4,13 | 1,73 | |
| P100_07 | Buffy coat | 139 | 1,74 |
| RBC | 1,00 | 1,70 | |
| P100_08 | Buffy coat | 118 | 1,87 |
| RBC | 3,72 | 1,78 | |
| P100_09 | Buffy coat | 51 | 1,87 |
| RBC | 0,23 | 0,98 |
Appendix. Utvärdering av den mängd DNA som finns i röda blodkroppar (RBC) skiktet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många mänskliga sjukdomar har genetiska orsaker och utforska den genetiska grunden för mänsklig sjukdom kräver en ökande högkvalitativt DNA. Den vanligaste källan av DNA som används i genetiska studier är antikoagulerat helblod. Eftersom de flesta kliniska laboratorier utför biokemiska, serologiska och virala testresultat som ett första steg i fenotypisk utfall utredning, blodet ofta samlas i en plasma rör. Efter uppsamling av plasma, är det komprimerade blod ofta kasseras. Därför, när DNA behövs för att utföra genetiska undersökningar eller tester, är ett ytterligare blodprov krävs från samma patient. Den kasserade komprimerade blodet utgör en potentiell källa till DNA som innehåller vita blodkroppar. Därför använder komprimerad blod från plasma rören ger en möjlighet att använda det insamlade blodprovet mer effektivt, utan att behöva dra överskott blod eller hämta patienten för ytterligare blod.
Olika metoder för att extarmkanalen DNA från de vita cellerna av packad eller levrat blod har rapporterats 6-10. De flesta av de utmaningar som dessa metoder var förknippade med utformningen av plasmauppsamlingsröret. Tidigare plasma samling rör innehöll en separator gjord av en gel (gel separator) som, när den centrifugeras, bildas en barriär för att separera blodceller (instängd nedanför separatorn) från plasmat (ovanför separatorn). För att förhindra förorening av blodkropparna med gelmaterialet, måste separatorn först försiktigt bort från röret 11. Detta följs av en fragmentering av blodproppen att garantera en effektiv DNA-extraktion. Fragmenteringen resulterar ofta i en betydande förlust av blodprov och en minskning av DNA-utbyte. För att minimera provförlust och förbättra processen, var en liten por mesh används för att mekaniskt skingrade blodpropp i små bitar 12, men fragmenteringen fortfarande påverkade DNA avkastning och kvalitet och even utgjorde en hälsorisk för teknikern 13.
BD P100 rör från BD Bioscience är den senaste generationen av plasma Uppsamlingsrör utvärderats i multicenter immunologisk forskningsstudie 14. Liksom de tidigare plasma rören, de innehåller antikoagulantia för att förhindra koagulering och proteashämmare för att stabilisera plasmaproteiner. Den stora nyheten i BD P100 röret finns i den mekaniska separatorn (inte en gel separator) inuti varje rör. Den mekaniska separatorn ger också en fysisk barriär mellan plasman och cellpelleten efter centrifugering, men till skillnad från gelen separatorn, erbjuder någon risk för kontamination av en gel. Protokollet tillämpas i denna studie inkluderar inte en splittring, därför finns det ingen hälsofara risk.
DNA extraherades från buffy coat, med användning av ett kommersiellt kit protokollet (se DNA-extraktion). Den komprimerade blod i BD P100 rören var cryopreserverad för en period av 3 till 4 månader innan DNA extraheras. DNA extraherat från EDTA-rör (EDTA_DNA) användes som en kontroll i bedömningen av avkastningen och kvaliteten på deras motsvarande P100_DNA. Från tidigare studier 12,13,15, var utbytena av EDTA_DNA proverna betydligt högre än av DNA från blod från tidigare plasma rören. I denna studie, för samma mängd helblod från varje patient, gav lättcellskoncentratet av den komprimerade blod mindre DNA (tabell 2, p = 0,00221). Under DNA-extraktion från blod i de nya P100 plasma rör, vissa vita blodkroppar från buffy kusten förlorade mot röda blodkroppar lagret (nedan det) men representerar obetydlig mängd DNA jämfört med de från buffy coat (se bilaga tabell). Variationen i avkastning ses med EDTA_DNAs också härmade med P100_DNA tyder på att det är prov beroende. Prover med högre volym skulle normalt ge mer DNA och provermed lägre volym och / eller något försämrad DNA skulle ge mindre DNA.
Analyser på agarosgel (figur 2) visade att EDTA_DNAs visar tecken på nedbrytning (cellprov) som inte setts i deras motsvarande P100_DNAs. I synnerhet två EDTA_DNA prover (EDTA_01053 och EDTA_06030) med den lägsta avkastningen visa fler smeta än andra. I deras studie, rapporterade Wong et al. 11 minskad DNA avkastning med ökad lagringstid. Eftersom alla blodprover i vårt förvar utsattes för samma förvaringsanvisningar och provet delmängd som används i denna studie valdes slumpmässigt, lagring längd och kondition är osannolikt att redovisa de skillnader som ses på agarosgel mellan P100_DNAs och EDTA_DNAs. Det faktum att endast EDTA_DNAs visar nedbrytning kan kopplas till avsaknaden av proteashämmare i EDTA-rör.
Renheten hos P100_DNAs och EDTA_DNAs skilde sig inte signifikant ( De använda proverna rekryterades för genetiska studier av inflammatorisk tarmsjukdom. Därför, för att jämföra resultaten för de extraherade DNA-prover, var immunochip 5 väljs som genotypning testplattform. Den immunochip har använts som en fin kartläggning genotypning plattform för Immunogenetics 16,17. Den genomet hela karaktären av SNP genotypning analyserna användes som en stringent mått på DNA-prestanda. De genomsnittliga genotypning samtalspriser för alla DNA-test och HapMap kontrollprover, i alla marker, var 97,76% och 97,4% respektive, visar jämförbara utmärkta prestanda av DNA från båda blodprovsrör ( Slutsats DNA kan isoleras från den komprimerade blod BD P100 tuber, underlättar genomisk test från samma blodprov dras för plasma proteomik studier. Våra resultat utvidga forskningen nyttan av P100 röret. Det faktum att DNA i den cellulära halten av blod samlas i P100 är användbar för genomiska analyser kan bidra till att förenkla provet förvärv för studier där både proteomik och genomiska analyser kommer att utföras. Därför är mindre blod behövs från varje människa och en tillhörande kostnader och besparingar fiskeansträngning för studien sponsorer och personal förbättras. Det finns flera bevisade fördelar:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A.
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C.
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
