我们提出了一个简单的协议,可视化地区的小鼠胚胎中的细胞程序性死亡(PCD)和鉴别胚胎干(ES)细胞培养,使用高度水溶性染料LysoTracker。
程序性细胞死亡(PCD)发生于成人,以维持正常组织稳态和胚胎发育过程中形成组织和器官1,2,6,7。在开发过程中,有毒化学物质或基因的改变可以导致PCD增加或改变PCD的模式,导致发育异常和出生缺陷3-5。要了解这些缺陷的病因学,胚胎的研究,使用区分胚胎干细胞(ES细胞) 在体外实验中,可以补充。
细胞凋亡是一种形式的PCD研究,既包括内在的和外在的信号,激活半胱天冬酶的酶级联。细胞特性的变化包括膜皱缩,核收缩,且DNA碎片。不涉及其他形式的PCD半胱天冬酶的激活,最终的结果可能是长期自噬。无论PCD的途径,死亡的细胞需要被删除。在成年人中,免疫细胞PERFORM功能,而在胚胎的免疫系统尚未开发,拆除产生的一种替代机制。这种机制涉及到邻近的细胞(称为“非专业吞噬细胞”),吞噬作用,他们认识到表面上的死细胞和吞噬8-10“吃我”的信号。吞噬后,碎片带来的溶酶体降解。因此无论PCD机制,溶酶体活性的增加可以增加细胞死亡相关。
要学习PCD,一个简单的分析,可视化厚的组织和多层区分文化的溶酶体中是有用的。 LysoTracker染料是一种高度可溶性小分子,被保持在如酸性亚细胞溶酶体11-13。的染料是采取了通过扩散和通过循环。由于是不是一个障碍,可视化的PCD在厚厚的组织和多层次的文化渗透是可能的12,13 </支持>。与此相反,TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记法)分析14,仅限于小样本,组织切片和单层培养,因为此过程需要进入/渗透终端转移。
相反,扩散和溶解的溶剂苯胺蓝,DND-99 LysoTracker红,是可以解决的,明亮的,稳定的。染色可以可视化与标准荧光或共聚焦显微镜在整个贴装或部分,使用水性或溶剂型的安装媒体12,13。在这里,我们描述了使用此染料看,PCD在正常和 Sonic Hedgehog null小鼠胚胎的协议。此外,我们表现出ES细胞培养鉴别分析PCD,并提出一个简单的量化方法。总之,LysoTracker染色检测PCD的其他方法可以是一个很好的补充。
细胞凋亡的重要标志包括与TUNEL检测的DNA损伤的检测,沿与caspase活性的检测(检测的单克隆抗体或结合分子如ZVAD-芬兰马克),观察细胞的变化,和介绍的磷脂酰丝氨酸(PS )在膜表面上(Annexin V结合)中检测到的。与每个这些检测方法也有一些缺点。例如,TUNEL法检测中使用的末端转移不穿透超越几个细胞层。膜联蛋白V可以标记细胞不进行细胞凋亡,如那些具有的膜破坏,(膜联蛋白V得到在细?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢帮助编辑的马里亚尼实验室的协议。这项工作是由一个摆围博士后培训津贴(JLF),的CIRM的BRIDGES实习(TZTT),罗伯特·E.五月R.莱特基金会(FVM),美国南加州大学(FVM)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |||||||||||||||
Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |||||||||||||||
Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |||||||||||||||
Vectashield | VECTOR | H-1200 | |||||||||||||||
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |||||||||||||||
Non-essential amino acids | Cellgro | 25-025-CI | |||||||||||||||
Sodium pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |||||||||||||||
FBS | Hyclone | SH30071.02 | |||||||||||||||
Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | |||||||||||||||
b-Mercaptoethanol, 50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |||||||||||||||
LabTek-II Chamber slides (8-well) |
Nalge Nunc International | 154534 | |||||||||||||||
0.1% Gelatin | Millipore | ES-006-B | |||||||||||||||
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |||||||||||||||
Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml:
WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media:
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