שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

Summary

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדמיין אזורים של מות תאים מתוכן (PCD) בעוברי עכברים ומבדילים (ES) תרבויות תאי גזע עובריות באמצעות צבע מסיס מאוד בשם LysoTracker.

Abstract

מות תאים מתוכן (PCD) מתרחש אצל מבוגרים כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמה נורמלית ובמהלך ההתפתחות עוברית לעצב רקמות ואיברים ^1,2,6,7. במהלך פיתוח, כימיקלים רעילים או שינויים גנטיים יכולים לגרום לעלייה בPCD או לשנות דפוסי PCD כתוצאה מפרעות התפתחותיות ומומים מולדים ^3-5. כדי להבין את האטיולוגיה של ליקויים אלה, המחקר של עוברים ניתן כהשלמה עם במבחני חוץ גופייה המשתמשים במיון תאי גזע עובריים (ES).

אפופטוזיס הוא צורה נחקרה היטב של PCD שכרוך הוא פנימי וחיצוני כדי להפעיל איתות מפל האנזים caspase. שינויים בתא אופייני כוללים blebbing קרום, התכווצות גרעינית, ופיצול ה-DNA. צורות אחרות של PCD אינן כרוכות בהפעלת caspase ועלולה להיות סוף התוצאה של autophagy הממושך. ללא קשר למסלול PCD, תאים מתים שיהיה צורך להסירו. אצל מבוגרים, התאים החיסוניים ביצועיםORM פונקציה זו, ואילו בעוברים, שבו המערכת החיסונית אינה מפותחת עדיין, ההסרה מתרחשת על ידי מנגנון חלופי. מנגנון זה כרוך תאים שכנים (נקרא "phagocytes לא מקצועי") לוקחים על phagocytic תפקידים שהם מכירים "לאכול אותי" אות על פני השטח של התא ולבלוע אותו ^8-10 הגוססים. לאחר בליעה, הפסולת מובאת לlysosome לשפלה. לכן, ללא קשר למנגנון PCD, גידול בפעילות lysosomal יכול להיות מתואם עם מות תא מוגבר.

ללמוד PCD, assay פשוט לדמיין lysosomes ברקמות עבות ותרבויות מבדילות multilayer יכול להיות שימושי. צבע LysoTracker הוא מולקולה קטנה מסיסה מאוד שנשמרה בתאי subcellular חומציים כגון ^11-13 lysosome. הצבע הוא נלקח על ידי דיפוזיה ודרך מחזור הדם. מאז חדירה היא לא מכשול, ויזואליזציה של ללמוד במכללת פרינסטון ברקמות עבות ותרבויות רבות שכבתיות הוא אפשרי ^12,13 </sup>. לעומת זאת, ניתוח ¹⁴ Tunel (תיוג סוף transferase dUTP כינוי המסוף deoxynucleotidyl), מוגבל לדגימות קטנות, חתכים ההיסטולוגיים ותרבויות monolayer כי ההליך דורש כניסה / החדירות של מסוף transferase.

בניגוד לאנילין כחול, שמפזר ונמס בממסים, LysoTracker האדום DND-99 ניתן לתקן, בהיר ויציב. כתמים יכולים להיות דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal הסטנדרטי בכל הר-או סעיף באמצעות תקשורת מימית או ממס המבוסס על הרכבת ^12,13. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות צבע זה להסתכל על ללמוד במכללת פרינסטון בעוברי עכברי null קיפוד קולי הרגיל ו. בנוסף, אנו מדגימים ניתוח של PCD במבדל תרבויות תאי גזע עוברי, ולהציג שיטת כימות פשוט. לסיכום, כתמי LysoTracker יכולים להיות רב כדי להשלים שיטות אחרות לאיתור PCD.

Protocol

1. כתמי LysoTracker של עוברי עכברים צור עוברי עכברים ידי צבת (5-6 שבוע ישן) נקבות צעירות לתוך כלובי הרבעת זכרים. לפקח בבקרים הבאים להופעתו של תקע נרתיק המציין הזדווגות שהתרחשה. אם הנקבה בהריון, בצהריים באותו היום נקראים 0.5 DPC (י?…

Discussion

סימני היכר חשובים של אפופטוזיס כוללים זיהוי של ניזק לדנ"א עם assay Tunel, יחד עם זיהוי של פעילות caspase (מזוהה עם בז או מולקולה מחייבת כגון ZVAD-fmk), תצפית של שינויים תאיים, ומצגת של phosphatidylserine (PS ) על פני הקרום (זוהה על ידי Annexin V מחייב). יש כמה חסרונות בכל אחד מהמבחנים האלה. לדוגמה,…

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl