Het gebruik van LysoTracker tot geprogrammeerde celdood detecteren in embryo's en differentiëren van embryonale stamcellen

Summary

Wij presenteren een eenvoudig protocol om gebieden van geprogrammeerde celdood (PCD) in muizenembryo's en onderscheidende embryonale stamcellen (ES) celkweken met een sterk oplosbare kleurstof genoemd LysoTracker visualiseren.

Abstract

Geprogrammeerde celdood (PCD) voor bij volwassenen met normaal weefsel homeostase en tijdens embryonale ontwikkeling aan weefsels en organen ^1,2,6,7 vorm. Tijdens de ontwikkeling kan giftige chemicaliën of genetische veranderingen veroorzaken een toename van de PCD of wijzigen PCD patronen resulteert in ontwikkelings-afwijkingen en aangeboren afwijkingen ^3-5. De etiologie van deze gebreken begrijpen, kunnen de studie van embryo's aangevuld met in vitro assays die gebruik differentiëren embryonale stamcellen (ES) cellen.

Apoptose is een goed bestudeerde vorm van PCD dat zowel intrinsieke en extrinsieke signalering naar de caspase enzym cascade activeren omvat. Kenmerkend cel veranderingen omvatten membraan blaarachtig, nucleaire krimpen, en DNA-fragmentatie. Andere vormen van PCD niet betrokken caspase activiteit en kan het eindresultaat van langdurige autofagie. Ongeacht de route PCD, stervende cellen moeten worden verwijderd. Bij volwassenen zijn de immuuncellen perfOrm deze functie, terwijl embryo, waar het immuunsysteem nog niet ontwikkeld verwijdering gebeurt door een alternatief mechanisme. Het mechanisme omvat naburige cellen (de zogenaamde "niet-professionele fagocyten") het nemen van een fagocytische rol, ze herkennen het signaal 'ik eet' op het oppervlak van de stervende cel en overspoelen het ^8-10. Na afblazen, wordt het puin gebracht naar het lysosoom voor degradatie. Dus ongeacht PCD mechanisme, kan een toename van lysosomale activiteit gecorreleerd met verhoogde celdood.

Om PCD, een eenvoudige test om te lysosomen in dikke weefsels en multilayer differentiëren culturen visualiseren studeren kan nuttig zijn. LysoTracker kleurstof is een sterk oplosbare klein molecuul dat wordt vastgehouden in zure subcellulaire compartimenten zoals het lysosoom ^11-13. De kleurstof wordt door diffusie en door de circulatie. Omdat penetratie is niet een belemmering, visualisatie van PCD in dikke weefsels en multi-layer culturen is mogelijk ^12,13 </sup>. Daarentegen wordt TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analyse ¹⁴ tot kleine monsters, coupes en monolaagkweken omdat de procedure is de invoer / permeabiliteit van een terminal transferase.

In tegenstelling tot Aniline blauw, die verspreidt en wordt opgelost door oplosmiddelen, LysoTracker Red DND-99 is Muur, helder en stabiel. Kleuring kan zichtbaar worden gemaakt met standaard TL-of confocale microscopie in whole-mount of sectie met behulp van water of oplosmiddelen op basis van montage media ^12,13. Hier beschrijven we protocollen het gebruik van deze kleurstof te kijken naar PCD in normale en sonic hedgehog null muis embryo's. Daarnaast tonen we analyse van PCD in differentiëren ES celkweken zijn en een eenvoudige kwantificering methode. Samenvattend kan LysoTracker vlekken zijn een geweldige aanvulling op andere methoden voor het opsporen PCD.

Protocol

1. LysoTracker Kleuring van muizenembryo's Genereer muis embryo's door het plaatsen van jonge (5-6 weken oud) vrouwen in mannelijke stud kooien. Monitor op volgende ochtend voor het verschijnen van een vaginale plug aangeeft dat paring heeft plaatsgevonden. Als het vrouwtje zwanger is, wordt 's middags op de dag genaamd 0,5 dpc (dagen na coïtus). De procedure hier gepresenteerde is ideaal voor embryo's 7 tot 13 dpc. Op de embryonale dag van belang, euthanaseren de vrouwelijke overee…

Discussion

Belangrijke kenmerken van apoptose omvatten de detectie van DNA schade met de TUNEL assay, samen met de detectie van caspase activiteit (gedetecteerd met mAbs of een bindend molecuul zoals zVAD-fmk) de waarneming van cellulaire veranderingen, en de presentatie van fosfatidylserine (PS ) op het membraanoppervlak (gedetecteerd door Annexine V binding). Er zijn enkele nadelen met elk van deze assays. Bijvoorbeeld, de terminal transferase in de TUNEL assay niet doordringen dan een paar cellagen. Annexine V kan ook markeren …

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl