胚におけるプログラム細胞死を検出するためのLysoTrackerの使用は、胚性幹細胞を分化

Summary

我々は、マウス胚とLysoTrackerと呼ばれる非常に水溶性染料を使用して差別化胚性幹（ES）細胞培養でプログラムされた細胞死（PCD）の領域を可視化するための単純なプロトコルを提示。

Abstract

プログラム細胞死（PCD）は、通常の組織の恒常性を維持し、胎生発育中の組織や臓器^1,2,6,7を形作るために成人に発生します。開発時には、有毒化学物質や遺伝子の変化は、PCDの増加の原因になったり、発育異常、先天性異常、結果^3-5で、PCDのパターンを変更することができます。これらの欠陥の原因を理解するために、胚の研究は、胚性幹（ES）細胞を分化使用in vitroアッセイで補完することができます。

アポトーシスは、カスパーゼ酵素カスケードを活性化するシグナル伝達内因性及び外因性の両方が関与し、PCDのよく研究形態である。特徴的な細胞の変化は、膜ブレブ形成、核の縮小、およびDNA断片化が含まれています。 PCDの他の形態は、カスパーゼの活性化を伴わないと長引くオートファジーの最終結果かもしれません。かかわらず、PCD経路の、死細胞を除去することが必要。成人では、免疫細胞PERF胚では、免疫系がまだ発達していない場合には、除去、代替メカニズムによって発生している間は、この機能をORM。このメカニズムは、貪食役割彼らは瀕死細胞と巻き込むこと^8月10日の表面に"私を食べて"信号を認識する上で取る隣接するセル（以下、 "非専門食細胞"と呼ばれる）が含まれます。貪食した後、破片が分解のためのリソソームに運ばれます。したがってかかわらずPCD機構は、リソソーム活性の上昇は、細胞死の増加と相関させることができる。

PCDは、厚い組織と多層差別の文化ではリソソームを可視化するための単純な検定を勉強しておくと便利です。 LysoTracker染料は、リソソーム^11月13日のような酸性の細胞内区画内に保持される溶解性の高い小分子である。色素が拡散によって、循環を通じて取り上げられています。浸透は支障はないので、厚い組織と多層培養におけるPCDの可視化が可能である^12,13 </>（商標）。手順は、端末のエントリ/透トランスフェラーゼを必要とするので、これとは対照的に、TUNEL（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識）解析^14は 、小さなサンプル、組織切片、及び単層培養に制限されています。

拡散し、溶剤によって溶解されるアニリンブルー、とは対照的に、LysoTrackerレッドDND-99は、修正可能な明るく、かつ安定しています。染色はホールマウントまたは水性または溶剤ベースマウントメディア^12,13を使用^して、セクション内の標準的な蛍光または共焦点顕微鏡を用いて可視化することができます。ここではノーマルとソニックヘッジホッグヌルのマウス胚でPCDを見て、この染料を使用してプロトコルを記述。加えて、我々はES細胞培養物の区別にPCDの分析を示し、単純な定量化法を提案する。要約すると、LysoTracker染色は、PCDを検出する他の方法に大きな補完することができます。

Protocol

1。マウス胚のLysoTracker染色男性のスタッドケージに若い（5-6週齢）の雌を配置することによって、マウスの胚を生成します。その交配を示す膣栓の外観については、次の朝にはモニタが発生しました。女性が妊娠している場合は、その日の正午は0.5 DPC（日後に性交）と呼ばれています。ここで紹介する手順は、胚7月13日DPCに最適です。 興味のある胚当日は、承認されたプロト…

Discussion

アポトーシスの重要な特徴は、カスパーゼ活性の検出と共にTUNELアッセイによるDNA損傷、（例えばZVAD-FMKとしてmAbまたは結合分子で検出）の検出、細胞の変化を観察し、ホスファチジルセリン（PSのプレゼンテーションを含める膜表面上）（アネキシンV結合によって検出された）。これらのアッセイのそれぞれのいくつかの欠点があります。例えば、TUNELアッセイで使用されるターミナルトラ?…

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl