Brug af LysoTracker at opdage programmeret celledød i Embryoner og Differentiering embryonale stamceller

Summary

Vi præsenterer en enkel protokol til at visualisere regioner af programmeret celledød (PCD) i museembryoer og skelne embryostamceller (ES) cellekulturer under anvendelse af en meget opløseligt farvestof kaldet LysoTracker.

Abstract

Programmeret celledød (PCD) forekommer hos voksne til at opretholde normale væv homøostase og under embryologiske udvikling til at forme væv og organer ^1,2,6,7. Under udvikling, kan giftige kemikalier eller genetiske forandringer forårsage en stigning i PCD eller ændre PCD mønstre resulterer i udviklingsmæssige abnormaliteter og fosterskader ^3-5. For at forstå etiologien af disse defekter, kan undersøgelsen af embryoner suppleres med in vitro-assays, der bruger differentiere embryostamceller (ES)-celler.

Apoptose er en velundersøgte form af PCD, der involverer både interne og eksterne signaler at aktivere caspase enzym kaskade. Karakteristiske celleforandringer omfatter membran blæredannelse, nuklear skrumpning, og DNA-fragmentering. Andre former for PCD ikke indebærer caspaseaktivering og kan være den endelige resultat af langvarig autophagy. Uanset PCD pathway, døende celler skal fjernes. Hos voksne, perf de immuncellerOrm denne funktion, mens der i embryoer, hvor immunsystemet er endnu ikke udviklet, fjernelse sker ved en alternativ mekanisme. Denne ordning omfatter naboceller (kaldet "ikke-professionelle fagocytter") påtager sig en fagocytisk rolle-de anerkender den "æde mig" signal på overfladen af den døende celle og opsluge det ^8-10. Efter omslutning, er resterne bragt til lysosomet for nedbrydning. Således uanset PCD mekanisme, kan en stigning i lysosomal aktivitet korreleres med øget celledød.

At studere PCD, et simpelt assay til at visualisere lysosomer i tykke væv og flerlags differentierede kulturer kan være nyttigt. LysoTracker farvestof er en højt opløselig lille molekyle, der er fastholdt i sure subcellulære rum såsom lysosomet ^11-13. Farvestoffet optages af diffusion og gennem kredsløbet. Da penetration ikke er en hindring, visualisering af PCD i tykke væv og multi-lag kulturer er mulig ^12,13 </sup>. I modsætning hertil er TUNEL (Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end mærkningsmetoden) analyse ^14, begrænset til små prøver, histologiske sektioner og monolagskulturer, idet proceduren kræver indtastning / permeabiliteten af en terminal transferase.

I modsætning til Anilin blå, som diffunderer og opløses af opløsningsmidler, er LysoTracker Red DND-99 fixable, lyse og stabil. Farvning kan visualiseres med standard fluorescerende eller konfokal mikroskopi i hel-monteret eller afsnit ved hjælp af vandige eller opløsningsmiddelbaserede monteringsmedie ^12,13. Her beskriver vi protokoller ved hjælp af dette farvestof at se på PCD i normale og Sonic hedgehog null musefostre. Desuden udviser vi analyse af PCD i differentiere ES-cellekulturer og præsentere en enkel kvantificering fremgangsmåde. Sammenfattende kan LysoTracker farvning være en stor supplement til andre fremgangsmåder til detektion af PCD.

Protocol

1. LysoTracker farvning af musefostre Generer musefostre ved at placere unge (5-6 uger gamle) kvinder i mandlige stud bure. Overvåge den følgende morgen til forekomsten af ​​en vaginal prop indikerer, at parring har fundet sted. Hvis kvinden er gravid, er middag på denne dag kaldet 0,5 DPC (dage efter samlejet). Den procedure, der præsenteres her er ideel til embryoner 7-13 DPC. På den embryonal dag af interesse, aflive den kvindelige ifølge godkendte protokoller og fjerne livmoderen. Flyt…

Discussion

Vigtige kendetegn for apoptose omfatter påvisning af DNA-skader med TUNEL assay, sammen med påvisningen af ​​caspaseaktivitet (detekteret med mAb'er eller et bindende molekyle, såsom zVAD-fmk), observation af cellulære ændringer, og præsentationen af ​​phosphatidylserin (PS ) på membranoverfladen (detekteret ved Annexin V binding). Der er nogle ulemper ved hver af disse assays. For eksempel giver den terminale transferase anvendes i TUNEL-assayet ikke trænge igennem nogle få cellelag. Også Annexin …

Materials

Name of the reagent	Company		Catalogue number
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	#L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyde	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Non-essential amino acids	Cellgro	25-025-CI
Sodium pyruvate	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0.1% Gelatin	Millipore	ES-006-B
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml: Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots. WARNING: Paraformaldehyde in ‘frill’ form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media: DMEM: 404.5 ml FBS: 75.0 ml L-Glutamine: 5.0 ml Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml Non-essential amino acids: 5.0 ml Sodium pyruvate: 5.0 ml β-Mercaptoethanol: 500 μl