Fremstilling af<em> Drosophila</em> Centrale neuroner for<em> In situ</em> Patch Clamping
Summary
In situ patch clamp-optagelser anvendes til elektrofysiologisk karakterisering af neuroner i intakt kredsløb. I Drosophila genetisk model patch fastspænding er vanskelig, fordi de CNS er lille og omgivet af en robust kappe. Denne artikel beskriver procedure for at fjerne hylsteret og rene neuroner for efterfølgende patch clamp optagelser.
Abstract
Korte generation tider og letkøbte genetiske teknikker gør bananfluen Drosophila melanogaster en fremragende genetisk model i fundamental neurovidenskab forskning. Ionkanaler er grundlaget for al adfærd, da de medierer neuronal excitabilitet. Den første spænding gated ion klonet kanal var Drosophila spænding gated kaliumkanal Shaker 1,2. Til forståelse rolle for ionkanaler og membran excitabilitet for nervesystemet funktion er det nyttigt at kombinere stærke genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila med in situ patch clamp optagelser. I mange år har sådanne optagelser er blevet vanskeliggjort af den lille størrelse af Drosophila CNS. Desuden en robust kappe fremstillet af glia og kollagen udgjorde hindringer for patch pipette adgang til centrale neuroner. Fjernelse af denne kappe er en nødvendig forudsætning for patch clamp optagelser fra enhver neuron i den voksne Drosophila CNS. I de senere årforskerne har været i stand til at udføre in situ patch clamp optagelser fra neuroner i den voksne hjerne 3,4 og ventrale nerve ledning af embryonale 5,6, larve 7,8,9,10 og voksne Drosophila 11,12,13,14. En stabil giga-forsegling er den vigtigste forudsætning for et godt plaster og afhænger af ren kontakt af patch-pipetten med cellemembranen for at undgå lækage strømme. Derfor skal for hel-celle in situ patch clamp optagelser fra voksne Drosophila neuroner renses grundigt. I det første trin, har ganglioniske kappe, der skal behandles enzymatisk og mekanisk fjernet for at gøre målcellerne tilgængelige. I det andet trin, har cellemembranen, der skal poleres, således at ingen lag af glia, collagen eller andet materiale kan forstyrre giga-forsegling formation. Denne artikel beskriver, hvordan man forbereder en identificeret central neuron i Drosophila ventrale nerve ledning, flyvningen motoneuron 5 (MN5 15), for somatiske hel cEll patch clamp optagelser. Identifikation og synligheden af neuron opnås ved målrettet ekspression af GFP i MN5. Vi har ikke til formål at forklare patch clamp-teknikken selv.
Protocol
Discussion
Når visualisere celler med fluorescerende proteiner såsom GFP, er det vigtigt at ikke overeksponere præparatet for for meget lys. Dette kan resultere i foto skader. Vi bruger 100W HBO kortbue kviksølv pærer til belysning, og vi bruger også neutral tæthed (ND) på 0,8 (Chroma ND-filtre 0,3 og 0,5). For at kunne bedømme kvaliteten af rengøringsprocessen godt udsyn er afgørende. Derfor kan ND-filtre fjernes i korte perioder på omkring 20 s til flere gange.
Når de anvender nogl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O’Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
