הכנה<em> דרוזופילה</em> נוירונים מרכזיים עבור<em> באתר</em> התיקון clamping
Summary
בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן.
Abstract
זמני דור קצרים וטכניקות גנטיות שטחיות להפוך זבוב דרוזופילה melanogaster מודל גנטי מצוין במחקר מדעי המוח יסודי. תעלות יונים הן בסיס לכל ההתנהגות שכן הם לתווך רגישות עצבית. הערוץ הראשון המתח מגודר היון המשובט היה ערוץ תסיסנית המתח המגודר אשלגן אכר 1,2. לקראת הבנת תפקידו של תעלות יונים ורגישות הממברנה לתפקוד מערכת עצבים כדאי לשלב כלים גנטיים רבים עצמה זמינות בדרוזופילה בהקלטות עם מהדק תיקון באתרו. במשך שנים רבות הקלטות כאלה כבר הקשו על ידי הגודל הקטן של מערכת העצבים המרכזיים תסיסנית. יתר על כן, נדן חזק עשוי גליה וקולגן היווה מכשולים לגישת פיפטה תיקון לנוירונים מרכזיים. הסרת מעטה זו היא תנאי הכרחי להקלטות מהדקות תיקון מכל תא עצב במערכת עצבים מרכזיים תסיסנית הבוגרת. בשנים האחרונותמדענים הצליחו לבצע בהקלטות מהדקות תיקון באתרו מתא העצב במוח הבוגר 3,4 וחוט עצב גחון של עוברי 5,6, זחל 7,8,9,10, ומבוגר תסיסנית 11,12,13,14. יציב גיגה חותם הוא התנאי העיקרי לתיקון טוב ותלוי במגע נקי של פיפטה התיקון עם קרום התא, כדי למנוע דליפת זרמים. לכן, לכל תא בהקלטות מהדקות תיקון באתרו מתאי עצב בוגרים תסיסנית יש לנקות ביסודיות. בשלב הראשון, את נדן ganglionic יש להתייחס enzymatically ומכאני הוסר כדי להפוך את תאי היעד נגישים. בשלב השני, קרום התא חייב להיות מלוטש כך שאין שכבה של גליה, קולגן או חומר אחר עלולה להפריע היווצרות גיגה חותם. מאמר זה מתאר כיצד להכין נוירון המרכזי זיהה את כבל תסיסנית גחון העצב, טיסת 5 motoneuron (MN5 15), לסומטי השלם גהקלטות מהדקות תיקון טו. זיהוי ונראות של נוירון מושג על ידי ביטוי ממוקד של ה-GFP בMN5. אנחנו לא שואפים להסביר את טכניקת מהדק התיקון עצמו.
Protocol
Discussion
כשמדמיינים את התאים עם חלבוני ניאון כמו GFP, חשוב לא מעל לחשוף את ההכנה ליותר מדי אור. זה עלול לגרום לניזק תמונה. אנו משתמשים בנורות 100W HBO קצרות קשת כספית לתאורה, ואנחנו משתמשים גם בצפיפות ניטראלית (ND) של 0.8 (מסנני ND Chroma 0.3 ו -0.5). כדי להיות מסוגל לשפוט על איכות הראות הטובה הנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O’Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
