Preparación de<em> Drosophila</em> Las neuronas centrales para<em> In situ</em> Parche de sujeción
Summary
En el parche situ clamp grabaciones se utilizan para la caracterización electrofisiológica de las neuronas en los circuitos intactos. En el modelo genético de Drosophila sujeción parche es difícil porque el SNC es pequeño y rodeado por una vaina robusta. En este artículo se describe el procedimiento para retirar las neuronas vaina y limpia para posteriores grabaciones de patch clamp.
Abstract
Los tiempos cortos de generación y fáciles técnicas genéticas que la mosca de la fruta Drosophila melanogaster un excelente modelo genético fundamental en la investigación en neurociencias. Los canales iónicos son la base de todo el comportamiento ya que median en la excitabilidad neuronal. El canal primer voltaje de iones cerrada clonado fue el canal de potasio voltaje Drosophila cerrada Shaker 1,2. Hacia la comprensión del papel de los canales iónicos y la excitabilidad de la membrana para la función del sistema nervioso es útil combinar poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila in situ con grabaciones de patch clamp. Durante muchos años, estas grabaciones se han visto obstaculizados por el pequeño tamaño de las CNS Drosophila. Además, una funda robusta hecha de colágeno y células gliales constituyen obstáculos para el acceso parche pipeta a las neuronas centrales. La eliminación de esta vaina es una condición previa necesaria para las grabaciones de patch clamp de cualquier neurona en el adulto CNS Drosophila. En los últimos añoslos científicos han sido capaces de llevar a cabo in situ patch clamp grabaciones de las neuronas en el cerebro adulto y 3,4 cordón nervioso ventral embrionario de 5,6, 7,8,9,10 larval y adulto de Drosophila 11,12,13,14. Un establo giga-sello es la principal condición previa para un buen parche y depende del contacto limpio de la pipeta de parche con la membrana celular para evitar corrientes de fuga. Por lo tanto, para la célula completa in situ grabaciones de patch clamp de neuronas adultas de Drosophila se debe limpiar a fondo. En el primer paso, la vaina ganglionar tiene que ser tratada enzimáticamente y eliminar por medios mecánicos para hacer las células diana accesible. En el segundo paso, la membrana de la célula tiene que ser pulido para que ninguna capa de material de glia, colágeno u otro puede perturbar giga-sello formación. En este artículo se describe cómo preparar una neurona identificado central en el cordón nervioso ventral Drosophila, el vuelo de las motoneuronas 5 (MN5 15), para somática toda cell grabaciones de patch clamp. Identificación y visibilidad de la neurona se consigue mediante la expresión dirigida de GFP en MN5. Nuestro objetivo no es explicar la técnica de patch clamp en sí.
Protocol
Discussion
Cuando la visualización de las células con proteínas fluorescentes como GFP, es importante no sobre-exponer la preparación de un exceso de luz. Esto puede resultar en el daño por luz. Nosotros utilizamos bombillas de 100W HBO cortos de arco de mercurio para la iluminación, y también utilizamos densidad neutra (ND) de 0,8 (Chroma filtros ND de 0,3 y 0,5). Para ser capaz de juzgar la calidad de la visibilidad de limpieza es crucial. Por lo tanto, filtros ND se puede eliminar por períodos cortos de aproximadamente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
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