Подготовка<em> Drosophila</em> Центральный нейронов<em> На месте</em> Patch Зажимная
Summary
На месте патч зажим записи используются для электрофизиологических характеристик нейронов у интактных схемы. В Drosophila генетической модели патч зажимной трудно, потому что ЦНС является небольшой и окружен надежными оболочки. В данной статье описывается процедура удаления оболочки и чистой нейронов для последующей записи зажим патч.
Abstract
Короткие сроки производства и поверхностное методов генной сделать плодовой мушки дрозофилы отличную генетическую модель в фундаментальных исследованиях нейронауки. Ионные каналы являются основой любого поведения, так как они посредником возбудимости нейронов. Первый напряжения закрытого ионных каналов клонированных было напряжение Drosophila закрытом калиевого канала Шейкер 1,2. К пониманию роли ионных каналов мембран и возбудимости нервной системы целесообразно объединить мощные генетические инструменты, доступные в дрозофилы с записями на месте зажим патч. На протяжении многих лет такие записи были затруднены небольшой размер CNS дрозофилы. Кроме того, надежная оболочка из глии и коллаген составляет препятствия для патч пипетки доступ к центральным нейронам. Удаление этой оболочки является необходимой предпосылкой для записи патч зажим от любого нейрона в ЦНС взрослых дрозофилы. В последние годыученые смогли провести на месте записи зажим патч от нейронов в мозгу взрослого 3,4 и брюшной нервной эмбриональных 5,6, 7,8,9,10 личиночных и взрослых Drosophila 11,12,13,14. Стабильная гига-печать является основным условием для хорошего патча и зависит от чистой контакт патч пипетки с клеточной мембраной, чтобы избежать утечки тока. Поэтому для целых клеток на месте патч зажим записи от взрослых нейронов дрозофилы должны быть тщательно очищены. На первом этапе, ганглиозных оболочка должна рассматриваться ферментативно и механически удалить, чтобы сделать клетки-мишени доступны. На втором этапе, клеточная мембрана должна быть отполированы так, что ни один слой материала глии, коллагена или других может нарушить гига-уплотнение образование. В этой статье описывается, как подготовить определены центрального нейрона в Drosophila брюшной нервной, полет мотонейронов 5 (MN5 15), для соматических целом сELL записи патч зажим. Идентификация и видимость нейрона достигается за счет целевых выражения GFP в MN5. Мы не стремимся, чтобы объяснить технику патч зажим себя.
Protocol
Discussion
При визуализации клеток с флуоресцентными белками, как GFP, важно не переэкспонировать подготовки к слишком много света. Это может привести к повреждению фото. Мы используем 100W HBO коротких дуговых ртутных ламп для освещения, и мы также используем нейтральной плотности (ND) от 0,8 (Chroma фильтр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O’Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
