Herstellung<em> Drosophila</em> Central Neuronen<em> In situ</em> Patch Clamping
Summary
In situ Patch Clamp Messungen sind für elektrophysiologische Charakterisierung von Neuronen im intakten Schaltung verwendet. In der Drosophila genetische Modell Patch-Clamp ist schwierig, weil das ZNS ist klein und umgeben von einer robusten Hülle. Dieser Artikel beschreibt die Vorgehensweise, um die Scheide und sauber Neuronen für nachfolgende Patch Clamp Messungen entfernen.
Abstract
Short Generationszeiten und einfache genetische Techniken machen die Fruchtfliege Drosophila melanogaster eine hervorragende genetische Modell in grundlegenden neurowissenschaftlichen Forschung. Ionenkanäle sind die Grundlage aller Verhalten, da sie die neuronale Erregbarkeit zu vermitteln. Die erste Spannung Ionenkanal geklont war der Drosophila Spannung Kaliumkanal Shaker 1,2. Gegen das Verständnis der Rolle von Ionenkanälen und Membranerregbarkeit für die Funktion des Nervensystems ist es sinnvoll zu kombinieren leistungsfähige genetische Werkzeuge in Drosophila mit in situ Patch Clamp Messungen. Seit vielen Jahren solche Aufnahmen wurden von der geringen Größe der Drosophila CNS behindert worden. Darüber hinaus bildeten eine robuste Hülle aus Glia und Kollagen Hindernisse für Patch-Pipette Zugang zu zentralen Neuronen. Das Entfernen dieser Hülle ist eine notwendige Voraussetzung für Patch Clamp Messungen von jedem Neuron in der erwachsenen Drosophila CNS. In den letzten JahrenWissenschaftler konnten in situ Patch Clamp Messungen von Neuronen im erwachsenen Gehirn 3,4 und Bauchmark von embryonalen 5,6, Larven 7,8,9,10 und erwachsenen Drosophila 11,12,13,14 befragen. Eine stabile Giga-Dichtung ist die wichtigste Voraussetzung für eine gute Patch und hängt von sauberen Kontakt der Patch-Pipette mit der Zellmembran, um Kriechströme zu vermeiden. Daher muss für die gesamte Zelle in situ Patch Clamp Messungen von erwachsenen Drosophila Neuronen gründlich gereinigt werden. Im ersten Schritt hat der Ganglien-Hülle an enzymatisch behandelt und mechanisch entfernt, um die Zielzellen zu erreichen. Im zweiten Schritt hat der Zellmembran so poliert werden, dass keine Schicht aus Glia, Kollagen oder anderen Materials kann Giga-Dichtung Formation zu stören. Dieser Artikel beschreibt, wie Sie einen identifizierten zentralen Neuron in der Drosophila Bauchmark, die Flucht Motoneuron 5 (MN5 15), bereiten für somatische ganzen cell Patch Clamp Messungen. Identifizierung und Sichtbarkeit des Neurons wird durch gezielte Expression von GFP in MN5 erreicht. Wir zielen nicht auf die Patch-Clamp-Technik selbst zu erklären.
Protocol
Discussion
Wenn die Visualisierung der Zellen, die mit fluoreszierenden Proteinen wie GFP, ist es wichtig, nicht zu stark freizulegen die Herstellung zu viel Licht. Dies kann im Foto führen. Wir verwenden 100W HBO Kurzbogen Quecksilberbirnen für die Beleuchtung, und nutzen wir auch neutrale Dichte (ND) von 0,8 (Chroma ND-Filter 0,3 und 0,5). Um die Qualität des Reinigungsprozesses gute Sichtbarkeit beurteilen ist entscheidend. Daher kann ND-Filter für kurze Zeiträume von etwa 20 s für mehrere Male entfernt werden.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
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