Framställning av<em> Drosophila</em> Centrala neuroner för<em> In situ</em> Patch Clamping
Summary
In situ patch clamp inspelningar används för elektrofysiologiska karakterisering av nervceller i intakt kretsar. I Drosophila genetisk modell patch fastspänning är svårt eftersom CNS är liten och omges av en robust hölje. I den här artikeln beskriver det förfarande för att ta bort hylsan och rena nervceller för efterföljande inspelningar patch clamp.
Abstract
Korta generationens tider och enkel genetiska tekniker gör bananfluga Drosophila melanogaster ett utmärkt genetisk modell i grundläggande neurovetenskap forskning. Jonkanaler är grunden för alla beteenden, eftersom de förmedlar neuronala retbarhet. Den första spänningen jonkanal klonat var Drosophila spänningsstyrda kaliumkanal Shaker 1,2. Mot förstå den roll jonkanaler och membran upphetsning för nervsystemets funktion är det bra att kombinera kraftfulla genetiska verktyg som finns i Drosophila med in situ patch clamp inspelningar. Under många år sådana inspelningar har hämmats av den lilla storleken hos Drosophila CNS. Dessutom utgjorde en robust hölje av glia och kollagen hinder för patch pipett tillgång till centrala neuroner. Borttagning av denna hölje är en nödvändig förutsättning för inspelningar patch clamp från någon neuron i den vuxna Drosophila CNS. Under de senaste årenforskarna har kunnat föra in situ inspelningar patch clamp från nervceller i den vuxna hjärnan 3,4 och ventrala nerv ur embryonala 5,6, larver 7,8,9,10 och vuxna Drosophila 11,12,13,14. En stabil giga-tätning är den viktigaste förutsättningen för en god lapp och beror på ren kontakt av plåstret pipetten med cellmembranet för att undvika överslag. Därför måste för helcells in situ inspelningar patch clamp från vuxna Drosophila nervceller rengöras grundligt. I det första steget, har den ganglionisk manteln som skall behandlas enzymatiskt och mekaniskt bort för att göra målcellerna tillgängliga. I det andra steget, har cellmembranet kan poleras så att inget skikt av glia, kollagen eller annat material kan störa giga-tätning bildning. I denna artikel beskrivs hur du förbereder en identifierad centrala neuron i Drosophila ventrala nerv sladd, flygningen motoneuron 5 (MN5 15) för somatisk hela CELL patch clamp inspelningar. Identifiering och synlighet av neuron uppnås genom målinriktad uttryck av GFP i MN5. Vi syftar inte att förklara tekniken patch clamp själv.
Protocol
Discussion
När visualisera celler med fluorescerande proteiner som GFP, är det viktigt att inte över-exponera beredningen för mycket ljus. Detta kan resultera i foto skador. Vi använder 100W HBO korta glödlampor båge kvicksilver för belysning, och vi också använda neutral densitet (ND) i 0,8 (Chroma ND filter 0,3 och 0,5). För att kunna bedöma kvaliteten på rengöring god sikt är avgörande. Därför kan ND filter tas bort under kortare perioder på ca 20 s för flera gånger.
Vid tilläm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O’Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
