Om de mutualisme tussen studeren<em> Xenorhabdus</em> Bacteriën en<em> Steinernema</em> Nematoden, methoden ontwikkeld om bacteriële aanwezigheid en locatie binnen nematoden volgen. De experimentele benadering, die kan worden toegepast op andere systemen, houdt techniek bacteriën het groen fluorescent eiwit en visualiseren expressie, met fluorescentiemicroscopie bacteriën in de transparante nematode.
Symbiose, het samenleven van twee of meer organismen, zijn wijdverspreid in alle koninkrijken van het leven. Als twee van de meest gebruikte organismen op aarde, nematoden en bacteriën vormen een breed scala van symbiotische associaties die variëren van gunstig pathogene 1-3. Een van deze vereniging is de wederzijds voordelige relatie tussen Xenorhabdus bacteriën en Steinernema nematoden, die zich ontpopt als een modelsysteem van symbiose 4. Steinernema nematoden zijn entomopathogene, met behulp van hun bacteriële symbiont te doden insecten 5. Voor overdracht tussen insect gastheren, de bacteriën koloniseren de darm van besmettelijke de nematode de juveniele fase 6-8. Onlangs hebben diverse andere nematode species aangetoond bacteriën gebruiken insecten te doden 9-13, en onderzoeken begonnen onderzoeken van de interacties tussen de nematoden en bacteriën in deze systemen <sup> 9.
We beschrijven een werkwijze voor visualisatie van een bacteriële symbiont in of op een nematode gastheer te maken van de optische transparantie van nematoden wanneer bekeken door microscopie. De bacteriën zijn ontworpen om een fluorescent eiwit tot expressie, zodat de visualisatie met fluorescentiemicroscopie. Veel plasmiden beschikbaar die dragen genen die coderen voor eiwitten die fluoresceren bij verschillende golflengten (bijvoorbeeld rood of groen), en conjugatie van plasmiden van een donor Escherichia coli-stam in een ontvanger bacteriële symbiont is succesvol voor een groot aantal bacteriën. De beschreven methoden zijn ontwikkeld om de associatie tussen Steinernema carpocapsae en Xenorhabdus nematophila 14 te onderzoeken. Soortgelijke methoden zijn gebruikt om andere nematode-bacterie associaties 9, 15-18 onderzoeken en de aanpak derhalve algemeen toepasbaar is.
The Method maakt karakterisering van bacteriële aanwezigheid en lokalisatie binnen nematoden in verschillende stadia van ontwikkeling, het verstrekken van inzicht in de aard van de vereniging en het proces van kolonisatie 14, 16, 19. Microscopische analyse onthult zowel kolonisatie frequentie binnen een populatie en lokalisatie van bacteriën gastheerweefsels 14, 16, 19-21. Dit is een voordeel ten opzichte van andere methoden om bacteriën in nematode populaties, zoals sonicatie 22 of slijpen 23, welke kan gemiddelde niveau van kolonisatie, maar mag bijvoorbeeld populaties onderscheid met een hoge frequentie van laag symbiont ladingen van populaties met een lage frequentie van hoge belastingen symbiont. Discrimineren de frequentie en belasting van koloniserende bacterie kan vooral van belang bij het screenen of het karakteriseren van bacteriële kolonisatie mutanten fenotypes 21, 24. Inderdaad, fluorescentie microscopie gebruikt in high throughput screening van bacteriële mutanten voor gebreken in kolonisatie 17, 18, en is minder arbeidsintensief dan andere methoden, zoals sonicatie 22, 25-27 en individuele nematode dissectie 28, 29.
De hier beschreven protocol verschaft een werkwijze voor de optische detectie van bacteriën in een nematode host (figuur 1). Deze methode maakt gebruik van de optische transparantie van nematoden en het vermogen om fluorescent label bacteriën, waardoor in vivo analyse van bacteriën in de nematode host (figuur 3). Bijzonder heeft deze benadering identificeert bacteriële lokalisatie in ontvanger. Door het tellen van een nematodenpopulatie en scores voor bacteriële aanwezighe…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby suiker, Eric Stabb, en Todd Ciche bedanken voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol en instrumenten die worden gebruikt. KEM en JMC werden ondersteund door National Institutes of Health (NIH) National Research Service Award T32 (AI55397 "Microben in gezondheid en ziekte"). JMC werd ondersteund door een National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (IOS-0920631 en IOS-0950873).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |