Para estudar o mutualismo entre<em> Xenorhabdus</em> Bactérias e<em> Steinernema</em> Nemátodos, foram desenvolvidos métodos para monitorizar a presença de bactérias e localização no interior de nemátodos. A abordagem experimental, a qual pode ser aplicada a outros sistemas, implica bactérias engenharia para expressar a proteína fluorescente verde e visualização, por meio de bactérias de microscopia de fluorescência dentro do nemátodo transparente.
Simbioses, a convivência de dois ou mais organismos, são comuns em todos os reinos da vida. Como dois dos organismos mais ubíquos na Terra, nemátodos e bactérias formam uma grande variedade de associações simbióticas que vão desde benéfico para patogénico 1-3. Uma associação como é o relacionamento mutuamente benéfico entre as bactérias e nematóides Steinernema Xenorhabdus, que emergiu como um sistema modelo de simbiose 4. Nematóides entomopatogênicos Steinernema são, usando seu simbionte bacteriano para matar insetos 5. Para a transmissão entre os hospedeiros de insetos, as bactérias colonizam o intestino do nematóide juvenil fase infecciosa 6-8. Recentemente, várias outras espécies de nematóides foram mostrados para utilizar as bactérias para matar insectos 9-13, e começaram investigações examinar as interacções entre os nemátodos e bactérias nestes sistemas <sup> 9.
Descreve-se um método para a visualização de um simbionte bacteriano dentro ou sobre um hospedeiro de nematóides, tirando partido da transparência óptica de nemátodos, quando vistas através de microscopia. As bactérias são manipuladas para expressar uma proteína fluorescente, permitindo a sua visualização por microscopia de fluorescência. Estão disponíveis muitos plasmídeos que transportam genes que codificam proteínas que fluorescem a diferentes comprimentos de onda (ou seja, verde ou vermelha), e de conjugação de plasmídeos a partir de uma estirpe de Escherichia coli doador em um receptor symbiont bacteriana é bem sucedida para uma ampla gama de bactérias. Os métodos descritos foram desenvolvidos para investigar a associação entre Steinernema carpocapsae e nematophila Xenorhabdus 14. Métodos semelhantes têm sido utilizados para investigar outros nematóides bactéria associações de 9, 15-18 e, portanto, o método é geralmente aplicável.
O Method permite a caracterização da presença de bactérias e de localização dentro de nemátodos em diferentes fases de desenvolvimento, proporcionando insights sobre a natureza da associação e do processo de colonização 14, 16, 19. A análise microscópica revela tanto a frequência dentro de uma população de colonização e localização de bactérias aos tecidos do hospedeiro 14, 16, 19-21. Esta é uma vantagem sobre os outros métodos de monitorização de bactérias dentro das populações de nematóides, tais como a sonicação ou a trituração 22 23, o qual pode fornecer níveis médios de colonização, mas não pode, por exemplo, discriminar populações com uma alta frequência de baixa carga simbióticas de populações com uma baixa freqüência de cargas simbióticas elevados. Discriminando a freqüência ea carga de bactérias colonizadoras pode ser especialmente importante quando a seleção ou caracterização de bactérias mutantes para os fenótipos de colonização 21, 24. Com efeito, a microscopia de fluorescência tem sido utilizada na pesquisa de alto rendimento de mutantes bacterianos para defeitos de colonização 17, 18, e é menos trabalhosa do que outros métodos, incluindo a sonicação 22, 25-27 e dissecção de nemátodos individuais 28, 29.
O protocolo aqui descrito proporciona um método para a detecção óptica de bactérias dentro de um hospedeiro de nemátodos (Figura 1). Este método tira vantagem da transparência óptica dos nemátodos e a capacidade de bactérias fluorescentes de etiquetas, permitindo a análise in vivo das bactérias dentro do hospedeiro nematóide (Figura 3). Especificamente, esta abordagem identifica a localização de bactérias dentro de seu hospedeiro. Ao contar uma popula?…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Açúcar, Eric Stabb, e Todd Ciche por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo e as ferramentas utilizadas. KEM e JMC foram apoiados pelo National Institutes of Health (NIH) Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa T32 (AI55397 "Micróbios na saúde e na doença"). JMC foi apoiado pela National Science Foundation (NSF) graduação Bolsa de Investigação. Este trabalho foi suportado por concessões do National Science Foundation (IOS-0920631 e IOS-0950873).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
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Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
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Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
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Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
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Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |