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Biology

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

Published: October 19, 2012
doi:
10.3791/4298
, ,
1Department of Bacteriology,University of Wisconsin-Madison

Summary

間の共生を研究するために、<em> Xenorhabdus</em>細菌や<em> Steine​​rnema</em>線虫、これらの方法は、線虫内細菌の存在と位置を監視するために開発されました。他のシステムに適用することができる実験的なアプローチは、エンジニアリング細菌が透明な線虫の中に蛍光顕微鏡細菌を用いて、緑色蛍光タンパク質と可視化を表現するために必然的に伴う。

Abstract

共生、二つ以上の生物の一緒に生活は、人生のすべての王国全体に蔓延している。地球上で最も普遍的な生物の2のように、線虫や細菌は、その範囲の有益な1 から 3までに病原性共生協会の広い配列を形成する。そのような関連付けはXenorhabdus細菌と共生4のモデルシステムとして浮上している線虫Steinernema間の相互に有益な関係である。Steinernema線虫、昆虫5を殺すために彼らの共生細菌を用いて、昆虫である。昆虫のホスト間で伝送するために、細菌が線虫の感染幼若期6-8の腸にコロニーを形成する。最近、いくつかの他の線虫種は昆虫の9-13を殺すためにバクテリアを利用することが示されている、との調査は、これらのシステムにおける線虫や細菌間の相互作用を検討し始めている<> 9（商標）。

私たちは、顕微鏡で観察したときに線虫の光透過性を生かし、線虫ホスト内または上に共生細菌を視覚化するための方法を説明します。細菌は蛍光顕微鏡によりその可視化を可能にする、蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されています。多くのプラスミドは、異なる波長（ すなわち、緑色または赤色）、および受信者共生細菌へのドナー大腸菌株からのプラスミドの接合で蛍光を発するタンパク質をコードする遺伝子は、細菌の広い範囲のために成功して運ぶことが可能です。記載された方法は、Steinernema carpocapsaeとXenorhabdus nematophila 14との間の関連性を調べるために開発されました。同様のメソッドは他の線虫細菌団体9、15-18とアプローチを調査するために使用されているため、一般的に適用されます。

会ったHODは、協会と植民地化14、16、19のプロセスの本質への洞察を提供し、開発のさまざまな段階で線虫内細菌の存在および局在化の特性評価を可能にします。顕微鏡分析は、組織14、16、19から21をホストするために細菌の人口とローカライゼーション内で両方の植民地化の頻度を明らかにする。これは、植民地化の平均的なレベルを提供することができる超音波処理22または23を研削などの線虫個体群内の監視、細菌の他の方法よりも優れていますが、例えば、との集団から低いシンビオント負荷頻度の高い集団を差別しないことがあります高シンビオント負荷の低周波。植民地化の表現型21のための細菌変異株をスクリーニングまたは特性評価する場合、周波数と植民地化細菌の負荷を判別することは、特に重要になることがあります、24。確かに、蛍光顕微鏡を植民地化17、18の欠陥のための細菌の変異体のハイスループットスクリーニングに使用され、超音波処理22、25から27と個々の線虫郭28、29を含む他の方法よりも少ない労力であるされています。

Protocol

1。抱合を経由して蛍光細菌株の構築受容菌（共生者が検査する）やドナー株一夜を栽培しています。ドナー株、通常、 大腸菌（Escherichia coli）は 、共役を介してDNAの寄付や蛍光タンパク質をコードする遺伝子を運ぶこと（ 表2）プラスミドで形質転換されるべきであることが可能であるべきである。プラスミドに応じて、共役ヘルパー歪みが必要な場合もあります…

Discussion

ここで説明されたプロトコルは、線虫ホスト（ 図1）内の細菌を光学的に検出するための方法を提供する。この方法では、線虫のホスト（ 図3）内細菌の in vivo解析に有効に、線虫の光透過性と蛍光ラベル細菌に能力を活用しています。具体的には、このアプローチは、そのホスト内細菌の局在を識別します。細菌の存在のための線虫個体数およびスコア…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、使用されるこのプロトコルとツールの開発への彼らの貢献についてエウジェニオVivas、クルトHeungens、エリック·マルテンス、チャールズコールズ、ダービー砂糖、エリックStabb、とトッドCicheに感謝したいと思います。 KEMおよびJMCは、国立衛生研究所（NIH）の国立研究サービス賞T32（AI55397 "健康と疾患における微生物"）によってサポートされていました。 JMCは、大学院研究フェローシップ国立科学財団（NSF）によってサポートされていました。この作品は、国立科学財団（IOS-0920631およびIOS-0950873）からの補助金によって支えられている。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Lipid Agar
(sterile)		 8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil*
Stir media while pouring plates
*add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution
(sterile)		 7 ml corn syrup, 89 ml water
mix and autoclave
Egg Solution 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth
(sterile)		 5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water
mix and autoclave
Microfuge Fisher 13-100-675 Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge Beckman 366802 Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish Fisher 0875713
50 ml centrifuge tubes Fisher 05-539-6
15 ml centrifuge tubes Fisher 05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish Fisher 0875711Z Deeper than standard Petri dishes
24-well plate Greiner Bio-One 662000-06
Microscope The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
PBS
(sterile)		 8 g NaCL
0.2 g KCL
1.44 g Na2HPO4
0.24 g KH2PO4
1 L water

Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes Fisher 05-408-138 2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid Sigma D-1377 If needed, supplement media to a concentration or 1 mM
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References

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VisualizingBacteriaNematodesFluorescent MicroscopySymbiotic AssociationsXenorhabdus BacteriaSteinernema NematodesModel SystemEntomopathogenicBacterial SymbiontIntestineInfective Juvenile StageNematode SpeciesInteractionsVisualization MethodOptical TransparencyMicroscopyFluorescent ProteinPlasmidsEscherichia Coli Strain

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Murfin, K. E., Chaston, J., Goodrich-Blair, H. Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4298, doi:10.3791/4298 (2012).
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