형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로
Summary
사이의 mutualism을 공부하려면<em> Xenorhabdus</em> 박테리아와<em> Steinernema</em> nematodes, 방법은 세균의 존재와 nematodes 내 위치를 모니터링하기 위해 개발되었습니다. 다른 시스템에 적용 할 수있는 실험 방법은, 엔지니어링 박테리아가 투명 선충류에서 형광 현미경 박테리아를 사용하여 녹색 형광 단백질과 시각화를 표현하는 수반.
Abstract
Symbioses은 두 개 이상의 생물의 함께 사는 삶의 모든 왕국 전역에 널리 퍼져 있습니다. 지구상에서 가장 유비쿼터스 생물의 두 바와 같이, nematodes와 세균은 다양한 종류의 유익 1-3 병원성에 공생 협회의 다양한 배열을 형성하고 있습니다. 하나의 협회는 Xenorhabdus 박테리아와 공생 4의 모델 시스템으로 떠오르고있다 Steinernema nematodes, 사이의 상호 이익 관계입니다. Steinernema의 nematodes은 곤충에게 5 죽이기 위해 세균 symbiont을 사용하여 entomopathogenic 있습니다. 곤충 호스트 사이의 전송을 위해, 박테리아가 선충류의 infective의 청소년 단계 6-8의 장을 식민지화. 최근 몇 가지 다른 선충류 종은 곤충에게 9-13를 죽이고 박테리아를 활용하는 표시되었으며, 조사는 이러한 시스템에 nematodes와 박테리아 사이의 상호 작용을 조사하기 시작했습니다 <> 9 논의하게 될 것입니다.
우리는 현미경으로 볼 nematodes의 광학 투명성을 활용 이내 또는 선충류 호스트에 세균 symbiont의 시각화하기위한 방법을 설명합니다. 박테리아는 형광 현미경하여 시각화를 허용하는 형광 단백질을 표현하는 설계되었습니다. 많은 plasmids는 각각 다른 파장 (예 : 녹색 또는 빨간색), 그리고받는 세균 symbiont에 기증 대장균의 변종에서 plasmids의 활용에 형광 단백질을 인코딩 유전자가 박테리아의 광범위한 성공적으로 수행하는 사용할 수 있습니다. 설명 방법은 Steinernema carpocapsae와 Xenorhabdus nematophila 14 층 사이의 연결을 조사하기 위해 개발되었습니다. 비슷한 방법은 다른 선충류 – 세균 협회 9, 15-18을 조사하는 데 사용하고 접근 방식은 따라서 일반적으로 적용되었습니다.
메트로폴리스석탄 통은 협회와 식민지 14, 16, 19 과정의 성격에 통찰력을 제공, 개발의 여러 단계에서 nematodes에서 박테리아의 존재 및 현지화의 특성 수 있습니다. 현미경 분석은 조직 14, 16, 19-21를 호스팅하는 박테리아의 인구 및 현지화에서 식민지 주파수를 모두 보여줍니다. 여기에는 sonication 22 또는 식민지의 평균 수준을 제공 할 수있는 23, 연삭 등의 선충류의 인구, 내 세균을 모니터링하는 다른 방법에 비해 장점이지만, 예를 들어,있는 인구에서 낮은 symbiont로드의 높은 빈도로 인구 차별하지 않을 수 있습니다 높은 symbiont로드의 낮은 주파수. 식민지의 phenotypes 21 세균 돌연변이를 검사하거나 특성화 때 주파수 및 colonizing 박테리아의 부하를 차별하는 것은 특히 중요 할 수 있습니다24. 사실, 형광 현미경은 식민지 17, 18의 결함에 대한 세균의 돌연변이의 높은 처리량 검사에 사용하고, sonication 22, 25-27 및 개인 선충류의 해부 28, 29 등의 다른 방법보다 덜 힘든 것입니다되었습니다.
Protocol
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 선충류 호스트 (그림 1) 내 세균의 광학 감지하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 선충류 호스트 (그림 3)에서 박테리아의 생체 분석 있도록 nematodes의 광학 투명성과 휘황 라벨 박테리아 할 수있는 능력을 활용합니다. 특히,이 방법은 호스트 내에서 세균 현지화를 식별합니다. 박테리아의 존재에 대한 선충류 인구 및 점수를 계산함으로써,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 사용이 프로토콜과 도구의 발전에 기여 Eugenio Vivas, 커트 Heungens, 에릭 Martens, 찰스 Cowles, 다비 설탕, 에릭 Stabb, 그리고 토드 Ciche 감사하고 싶습니다. KEM 및 JMC는 건강의 국립 연구소 (NIH) 국립 연구 서비스 상 T32 (AI55397 "건강과 질병에 미생물")에 의해 지원되었다. JMC는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (NSF) 대학원의 연구 활동에 의해 지원되었다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (IOS-0920631 및 IOS-0950873)의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
| Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
| Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
| Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
| Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
| Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
| Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
| Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
| Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
| Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
| Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
| Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |
References
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