Summary
इस प्रोटोकॉल में, ई डब्ल्यू आलिंद अतालता चूहों में चलाता है के लिए योगदान है कि चूहों और इंसानों के दिलों में (भी हृदय melanocytes के रूप में जाना जाता है) मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह का एक उपन्यास आबादी की पहचान की.
Abstract
हम चूहों में आलिंद अतालता चलाता है कि योगदान करने के चूहों और इंसानों के दिलों में (भी हृदय melanocytes के रूप में जाना जाता है) मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह का एक उपन्यास आबादी की पहचान की. हृदय melanocytes की बिजली और जैविक गुणों की जांच करने के लिए हम हम नवजात murine cardiomyocytes अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है उन से व्युत्पन्न है कि माउस दिल से उन्हें अलग करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है. अधिक व्यापक पैच दबाना या जैव रासायनिक अध्ययन के लिए उपयुक्त स्वस्थ हृदय melanocytes प्राप्त करने के लिए, हम अलग और मूल त्वचीय melanocytes अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है उन पर आधारित हृदय melanocytes चढ़ाना के लिए एक परिष्कृत प्रक्रिया विकसित की है. परिष्कृत प्रक्रिया इस समीक्षा में प्रदर्शन किया और एक शुद्ध आबादी के रूप में या cardiomyocytes साथ चढ़ाया जा सकता है कि स्वस्थ मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं की बड़ी संख्या का उत्पादन किया जाता है.
Introduction
हमने हाल ही में मेलेनिन संश्लेषण एंजाइम व्यक्त और आकृति विज्ञान त्वचीय melanocytes सदृश कि चूहों और इंसानों के दिल में एक उपन्यास सेल आबादी की पहचान की. हम इन कोशिकाओं 'हृदय melanocytes' कहा जाता है और वे आलिंद अतालता अक्सर मनुष्यों में आरंभ चलाता है जहाँ से शारीरिक स्थानों में मौजूद हैं. हम भी हृदय melanocytes डीसीटी के germline विलोपन के साथ चूहों में आलिंद arrhythmias में योगदान मिला. कार्डिएक melanocytes कम वे सभी आलिंद कोशिकाओं के कम से कम 0.1% शामिल है, जहां माउस प्रांगण भर में वितरित कर रहे हैं. हृदय melanocytes की बिजली और जैविक गुणों की जांच करने के लिए हम Cre-inducible मेलानोसाईट विशिष्ट मार्कर का उपयोग माउस दिल से उन्हें अलग करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की है. हमारे प्रारंभिक प्रक्रिया नवजात murine cardiomyocytes और पैच दबाना रिकॉर्डिंग या पीसीआर विश्लेषण के लिए उपयुक्त कोशिकाओं के झुकेंगे बहुत छोटी संख्या को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों से विकसित किया गया था. हालांकि, चंगा में सुधार करने के लिएवें और electrophysiological विश्लेषण या जैव रासायनिक अध्ययन में गहराई से अधिक के लिए हृदय melanocytes, की व्यवहार्यता, हम त्वचीय melanocytes अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है उन से एक परिष्कृत प्रक्रिया विकसित की है. इस समीक्षा में वर्णित और प्रदर्शन की प्रक्रिया एक शुद्ध आबादी के रूप में या cardiomyocytes साथ चढ़ाया जा सकता है कि स्वस्थ हृदय melanocytes उत्पादन का लाभ दिया है.
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Protocol
1 आवश्यक समाधान और उपकरण तैयारी
- सबसे पहले, 15 मिनट के लिए उन्हें autoclaving द्वारा सर्जिकल उपकरण (सीधे आकार संदंश, घुमावदार आकार संदंश, सीधे आकार कैंची, और घुमावदार आकार कैंची) बाँझ. 121 डिग्री सेल्सियस पर. ऊतक क़ीमा के लिए उपयोग किया जाएगा एक सेट दिल और दूसरे सेट बाहर विदारक के लिए प्रयोग किया जाता है जहां उपकरणों, के 2 सेट तैयार करते हैं.
- निष्फल, फ़िल्टर्ड पानी की 900 मिलीलीटर में MCDB153 संस्कृति मीडिया के 1 पैकेट भंग और पाउडर भंग कर दिया है जब तक धीरे धीरे हलचल. 1.2 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट, या 15.7 मिलीग्राम सोडियम की बिकारबोनिट समाधान, माध्यम की अंतिम मात्रा के प्रत्येक लीटर के लिए तैयार है और जब तक भंग हलचल जा रहा [V / डब्ल्यू 7.5%] जोड़ें. फिर एक टिशू कल्चर हुड (जैव सुरक्षा कैबिनेट) में बाँझ शर्तों के तहत एक 0.2 माइक्रोन बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से मीडिया डालना, 1 एन एचसीएल या 1 एन NaOH या तो जोड़कर 7.2 पीएच को समायोजित करें. फिर मीडिया को इकट्ठा करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
- खुराक के लिए तैयारसंस्कृति मीडिया (माल सूची) को जोड़ें. आपूर्ति करता है मीडिया चढ़ाना कोशिकाओं के लिए आवश्यक है बस से पहले मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए.
- 10% FBS के साथ साथ एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ DPBS तैयार करें.
- DPBS प्लस एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) के 100 मिलीलीटर, अगला, trypsin के 0.25 जी (यूएसबी गोजातीय अग्न्याशय, गतिविधि> 2,500 खासियत इकाइयों / मिलीग्राम, ultrapure) जोड़कर एक 0.25% trypsin समाधान तैयार करते हैं.
- इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक अन्य आवश्यक उपकरण एक stereomicroscope, पेट्री डिश (10 सेमी), 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, 40 माइक्रोन सेल strainers, DPBS प्लस एंटीबायोटिक दवाओं, 60 मिमी संस्कृति व्यंजन और 35 मिमी संस्कृति व्यंजन शामिल हैं.
2 नवजात माउस पिल्ले से दिल अलग
- सबसे पहले, P2 नवजात माउस पिल्ले को P0 प्राप्त (एन = 6 से 8). EYFP एलील या लेबल को जेड / ईजी एलील: यह R26R के लिए या तो विषमयुग्मजी हैं कि पुरुषों के साथ डीसीटी-Cre समयुग्मक महिलाओं के प्रजनन से उत्पन्न पिल्ले का उपयोग करने के लिए सिफारिश की हैमेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह. दोनों R26R: EYFP और जेड / ईजी चूहों जैक्सन लेबोरेटरीज (स्टॉक संख्या क्रमश: 006148 और 003920,) से उपलब्ध हैं.
- अगला,, नवजात माउस पिल्ले euthanize एक शराब झाड़ू के साथ उनके चेस्ट पोंछे और फिर DPBS के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश में पिल्ले जगह है.
- सीने पर त्वचा में कटौती और निष्फल संदंश और कैंची से उरोस्थि और फिर एक stereomicroscope के तहत ध्यान से छाती खुला. नवजात माउस पिल्ले के दिलों संलग्न अटरिया के साथ पूरे दिल दूर करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहना तो बहुत छोटे हैं.
- DPBS में दिलों को धो लें और एक नया 10 सेमी पेट्री डिश को हस्तांतरण.
3 enzymatic पाचन
- एक टिशू कल्चर हुड (जैव सुरक्षा कैबिनेट) को excised दिल के साथ पेट्री डिश लाने और फिर हुड में बाँझ तकनीक का उपयोग कर नीचे चरणों का पालन करें.
- सबसे पहले, बाँझ DPBS प्लस एंटीबायोटिक दवाओं में दिलों तीन बार धोएं.
- एक में (एन = 6-8) दिलों रखें60 मिमी संस्कृति पकवान और डिश 0.5% trypsin समाधान के 6-8 मिलीलीटर जोड़ें.
- अगला, (आकार में 1 मिमी से भी कम) छोटे टुकड़ों में दिलों में कटौती और एक 5% सीओ 2 माहौल में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं.
- ऊष्मायन अवधि पूर्ण होने के बाद, एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कार्डियक ऊतक और पकवान से trypsin के परिणामस्वरूप समाधान डालना.
- फिर, जल्दी लेकिन धीरे एक 10 मिलीलीटर बाँझ पिपेट का उपयोग करते हुए, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब 30-50 बार में समाधान triturate.
- छानना इकट्ठा करने के लिए एक नया, स्वच्छ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप समाधान फ़िल्टर.
- अगला, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र में 240 x जी पर 50 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र. फिर, धीरे सतह पर तैरनेवाला बंद aspirate और बाँझ DPBS के 6-8 मिलीलीटर में शेष गोली resuspend. इस चरण 2 से अधिक बार दोहराएँ. यह कदम आलिंद myocytes और हृदय melanocytes छर्रों लेकिन फाई नीचे लाने नहीं हैfibroblasts के बाद broblasts छोटे होते हैं और सतह पर तैरनेवाला में रहेगा.
4 चढ़ाना कार्डिएक Melanocyte कोशिकाओं की तरह
- ध्यान से नाली या धोने समाधान (DPBS) बंद aspirate और MCDB संस्कृति मीडिया के 6 मिलीलीटर में गोली resuspend, centrifugation के बाद तीसरे कुल्ला के बाद जो की खुराक जोड़ दिया गया है.
- अब, एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट में resuspended समाधान आकर्षित और एक 35 मिमी पकवान में कोशिकाओं की जगह, या 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में, और एक 35 मिमी पकवान में 3 नवजात चूहों से पृथक हृदय कोशिकाओं पूल या अच्छी तरह से.
- एक 5% सीओ 2 के माहौल में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन सेते किसी भी स्वाधीन कोशिकाओं के साथ संस्कृति मीडिया से दूर aspirate और फिर DPBS के साथ एक बार प्लेटें कुल्ला. तब प्लेटों के लिए नए सिरे से मीडिया को जोड़ने और मीडिया हर 2 दिन की जगह. कोशिकाओं वयस्क सुनने से अलग जबकि नवजात या भ्रूण दिल से अलग कक्षों, ऊपर से 3 सप्ताह के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता हैटीएस अप करने के लिए 10 दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है.
वयस्क माउस दिल से 5 अलग कार्डिएक Melanocyte कोशिकाओं की तरह
- सबसे पहले, परिपक्व चूहों से दिलों को दूर (3-4 सप्ताह की उम्र में, एन = 3) चूहों को हेपरिन 100 यू intraperitoneal प्रशासन और फिर उन्हें euthanizing के बाद एक मध्य रेखा sternotomy के माध्यम से. यह इस प्रक्रिया के लिए चूहों euthanize को pentobarbital उपयोग करने के लिए सिफारिश की है, लेकिन इस दवा के सभी स्थानों में उपलब्ध नहीं है.
- इसके बाद, एक टिशू कल्चर हुड (जैव सुरक्षा कैबिनेट) में एंटीबायोटिक दवाओं युक्त बाँझ DPBS में excised दिलों धो लो. उन लोगों से किसी भी शेष रक्त को हटाने और फिर DPBS में एक बार और दिल कुल्ला करने घुमावदार विदारक संदंश के साथ थोड़ा दिल निचोड़.
- दिल से अटरिया और atrioventricular वलय निकालें (इन संरचनाओं मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह होते हैं) और एक 35 मिमी पकवान में excised ऊतकों के नमूनों जगह है.
- घुमावदार कैंची और बल प्रयोग छोटे टुकड़ों में दिल कटपुनश्च और फिर डिश 0.5% trypsin समाधान के 6-8 मिलीलीटर जोड़ें. फिर 45-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन सेते हैं.
- अब, आगे कदम 3.6 से शुरू उपरोक्त प्रक्रिया से चरणों का पालन करें.
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Representative Results
इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल हम पहले से murine हृदय से हृदय melanocytes के लिए अलग प्रकाशित एक की तुलना में एक बेहतर तकनीक है. यह प्रक्रिया हृदय मेलानोसाईट तरह कोशिकाओं लेबल मेलेनिन संश्लेषण एंजाइम विशिष्ट Cre-recombinase द्वारा संचालित फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग कार्यरत हैं. यह आलिंद myocytes से हृदय melanocytes भेद कि रूपात्मक मतभेद अभी तक (चित्रा 1 ए) विकसित नहीं किया है, हौसले से अलग भ्रूण या नवजात कोशिकाओं के साथ काम कर जब हृदय melanocytes लेबल करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. अलगाव कदम अच्छी तरह से चला गया है जब चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, आलिंद myocytes और हृदय melanocytes की एक काफी बड़ी संख्या में बस कुछ गैर पक्षपाती कोशिकाओं के साथ laminin लेपित पकवान का पालन करना होगा. इस मामले में पक्षपाती कोशिकाओं पकवान (पीले तीर चित्रा 1 ए, Arrowhead) के तल पर फ्लैट दिखाई देगा. दूसरी ओर, जब प्रक्रियाDure अच्छी तरह से काम नहीं करता है कोशिकाओं का सबसे गैर पक्षपाती हो जाएगा और अक्सर गोलाकार देखो और (हल्के नीले तीर, चित्रा 1 ए) गोल.
अलग कक्षों हरी प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग कल्पना कर रहे हैं, यह हृदय melanocytes हैं और कोशिकाओं आलिंद myocytes (चित्रा 1) हैं जो कोशिकाओं जो स्पष्ट है. (3.9 कदम) प्रोटोकॉल में ऊपर उल्लेख किया है, fibroblasts बड़ा आलिंद myocytes और हृदय melanocytes हिमपात, लेकिन छोटे हृदय fibroblasts नीचे लाने नहीं है कि कम बल centrifugation का उपयोग पृथक आलिंद कोशिकाओं के पूल से हटा रहे हैं. हौसले से अलग कक्षों अब एकल कक्ष electrophysiological रिकॉर्डिंग (चित्रा 2), एकल कोशिका आरएनए विश्लेषण या जैव रासायनिक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम यह भी सुसंस्कृत है और अप करने के लिए 21 दिनों के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अलग नवजात या भ्रूण आलिंद कोशिकाओं को बनाए रखा. इस में वर्णित संस्कृति शर्तों का उपयोगआलिंद myocytes पकवान से अलग और वे अलग कर रहे हैं के बाद 2-3 दिनों के भीतर मर जाते हैं प्रोटोकॉल, हृदय मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह आगे, अंतर और पैदा करना होगा. वे एक नवजात माउस दिल से अलग थे 5 दिनों के बाद स्वस्थ हृदय melanocytes चित्रा 3 ए में दिखाया गया. (चित्र 1 में दिखाया हौसले अलग कक्षों के खिलाफ) इन कोशिकाओं के आसपास किसी भी आलिंद myocytes की कमी नोट. इसके अलावा, इन हृदय melanocytes व्यापक वृक्ष के समान प्रक्रियाओं का विकास और बारीकी से भी दिन के एक ही नंबर (3B चित्रा) के लिए संस्कृति में किया गया है कि त्वचीय melanocytes सदृश है.
चित्रा 1 प्रतिनिधि (ए) डीआईसी और (बी) के हौसले मैं की GFP छवियोंएक भ्रूण (E19.5) से solated आलिंद कोशिकाओं डीसीटी-Z / ईजी माउस पिल्ला. सफेद तीर दोनों पैनलों में हृदय मेलानोसाईट पहचानती है. फ्लोरोसेंट मार्कर की सहायता के बिना, हृदय मेलानोसाईट की पहचान और पकवान से जुड़ी आलिंद myocytes (पीले तीर) से भेद करना मुश्किल है कि ध्यान दें. हल्के नीले तीर अच्छी तरह से पकवान के साथ संलग्न नहीं कर रहे हैं कि आलिंद कोशिकाओं को इंगित.
चित्रा 2 डीसीटी - / - हृदय melanocytes लंबे समय तक कार्रवाई संभावित अवधि प्रदर्शित करता है. (ए) हृदय डीसीटी +/- और (बी) हृदय डीसीटी से वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग - / - कोशिकाओं डीसीटी के अभाव में कार्रवाई संभावित अवधि बढ़ी हुई प्रदर्शित करता है. - / - सेल के एक आराम की क्षमता है डीसीटी जबकि डीसीटी +/- सेल के विश्राम क्षमता, -62 एम वी है-60 एम वी. लेविन एट अल से, अनुमति के साथ, reproduced. जे क्लीन. निवेश करते हैं. 119, 2920-2936 (2009).
चित्रा 3 अलग (ए) के प्रतिनिधि छवियाँ हृदय मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं और (बी) त्वचीय melanocytes. Melanocytes क्रमशः दिल और नवजात चूहों (P1) की त्वचा से अलग किया, और 5 दिनों के लिए तो सुसंस्कृत थे.
चित्रा 4 डीसीटी व्यक्त कोशिकाओं दिल आबाद. एक E13.5 माउस दिल की स्वस्थानी संकरण में (ए) डीसीटी अभिव्यक्ति से पता चलता हैफेफड़े नस ओएस (खुला नोक) के आसपास (भरा तीर). फेफड़े के नसों के भीतर डीसीटी पॉजिटिव कोशिकाओं (तीर) (बी) Immunofluorescent धुंधला. एक e16.5 माउस डीसीटी-lacZ दिल (तीर) के पीछे प्रांगण में डीसीटी पॉजिटिव कोशिकाओं (सी) एक्स लड़की धुंधला. अंडाकार रंध्र, कोरोनरी साइनस ओएस और अवर रग कावा के क्षेत्रों में रा पट साथ एक e17.5 डीसीटी-lacZ माउस दिल में (डी) एक्स लड़की धुंधला; इनसेट पैमाने = 500 माइक्रोन. एक DctCre +/- और R26R माउस पार करने से उत्पन्न (ई) वयस्क माउस (P60) फेफड़े के नसों और बाएं आलिंद के भीतर lacZ सकारात्मक कोशिकाओं (तीर) को दर्शाता है. एक शल्य चिकित्सा द्वारा हटा मानव फेफड़े के नस की अन्तःचूचुक पर immunofluorescent धुंधला (तीर) द्वारा पता लगाया (एफ) डीसीटी पॉजिटिव कोशिकाओं. पैनल को छोड़कर स्केल सभी पैनलों में = 500 माइक्रोन (बी और डी; पैमाने = 100 माइक्रोन) और पैनल (एफ; पैमाने = 50 माइक्रोन). लघुरूप: पी.वी., फेफड़े नस; ला, आलिंद छोड़ दिया; ए ओ, महाधमनी; पीए, pulmoआम धमनी; आरए, सही आलिंद; IVC, अवर रग कावा; एफओ, अंडाकार रंध्र; सीएस, कोरोनरी साइनस. लेविन एट अल से, अनुमति के साथ, reproduced. जे क्लीन. निवेश करते हैं. 119, 2920-2936 (2009).
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Discussion
कार्डिएक melanocytes सामान्यतः आलिंद अतालता चलाता को जन्म दे कि दिल के भीतर शारीरिक स्थानों में मौजूद हैं. इन क्षेत्रों में फेफड़े के नसों, atrioventricular वलय, पीछे बाएं आलिंद और अंडाकार रंध्र (चित्रा 4) शामिल हैं. इन कोशिकाओं arrhythmogenesis में खेलने भूमिका को समझते हैं, हम उन्हें अलग करने और उनके शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन करने के लिए तकनीक का विकास. हालांकि, हम इस तकनीक में सुधार के हृदय melanocytes की स्वस्थ और बड़ी मात्रा बहिर्जात उत्तेजनाओं को हृदय melanocytes की प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए आगे के अध्ययन की अनुमति होगी उपज कि मान्यता दी. इसके अलावा, बेहतर अलगाव की तकनीक भी सामान्य शरीर विज्ञान और बीमारी के दौरान आलिंद myocytes साथ हृदय melanocytes की बातचीत की जांच के लिए पढ़ाई की अनुमति दे सकता.
इस पत्र में हम ISOL करने के लिए डिजाइन प्रोटोकॉल से विकसित की है कि माउस दिल से व्यवहार्य मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह अलग करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णनत्वचा से melanocytes खा लिया. इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम दिल से मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह निकालने. नवजात दिल से हृदय melanocytes अलग जबकि वजह बीचवाला फाइब्रोसिस की वृद्धि हुई राशि के लिए परिपक्व दिल से हृदय melanocytes निकालने, अपेक्षाकृत सीधे आगे और अधिक कठिन है. इस प्रोटोकॉल में हम परिपक्व दिल से मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं को निकालने के लिए trypsin पाचन इस्तेमाल किया. हम trypsin, collagenase, और dispase के विभिन्न सांद्रता के शामिल है कि कई अलग एंजाइमी संयोजनों का परीक्षण इस प्रोटोकॉल का विकास करना.
हम trypsin द्वारा (अगले 15 मिनट के लिए) का पालन किया (पहले 30 मिनट के लिए) collagenase के संयोजन के साथ नवजात अटरिया इलाज शुरू में मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं की उच्च पैदावार का उत्पादन किया है कि पाया, लेकिन अलग कक्षों व्यवहार्यता कमी आई साथ कम स्वस्थ थे. दूसरी ओर, trypsin साथ पाचन अकेले मीटर से स्वस्थ मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं के एक मध्यम संख्या का उत्पादनature माउस दिल. इसलिए, हम अभी परिपक्व murine दिल से मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह अलग करने के लिए trypsin का उपयोग करना चाहिये. इसके अलावा, हम सख्ती परिपक्व माउस दिलों की पाचन trypsin के बाद उत्पादित घोल triturating व्यवहार्य मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं की उपज में सुधार पाया. हम चाहते हैं कि trypsin आंशिक रूप से झिल्ली चैनलों या चार्ज वाहक को पचाने की क्षमता है उल्लेख करना चाहिए, और पैच दबाना पढ़ाई करते समय इस चैनल घनत्व को प्रभावित कर सकता है. हम trypsin पाचन अलग, परिपक्व मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं की वर्तमान घनत्व को प्रभावित करता है, तो यह निर्धारित करने के लिए एक कठोर विश्लेषण बाहर नहीं किया जाता है जबकि हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है पढ़ाई में धाराओं या कार्रवाई क्षमता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं देखा है.
कार्डिएक मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह आकृति विज्ञान त्वचीय melanocytes (चित्रा 1 और चित्रा 3 <जैसा दिखता है कि दिल में एक बहुत ही विरल सेल आबादी (सभी आलिंद कोशिकाओं के कम से कम 0.1%) हैं/ Strong>). इस तथ्य के कारण दिल में मौजूद अपेक्षाकृत कुछ हृदय melanocytes कर रहे हैं; हाल ही में जब तक हम केवल एकल कोशिका assays (यानी पैच clamping रिकॉर्डिंग या एकल कोशिका पीसीआर) के लिए उन्हें इस्तेमाल करने में सक्षम है. हालांकि, हम 20-30 नवजात, या 5-8 परिपक्व दिल पूलिंग से हृदय melanocytes की बड़ी मात्रा में प्राप्त की, और इस दृष्टिकोण immunoblot या जैव रासायनिक assays के प्रदर्शन के लिए ऊतक के लिए पर्याप्त मात्रा में पाया जाता है. वे हम अक्सर 15-20 मिमी परिपत्र जगह होगी पृथक किया गया है के बाद इसके अलावा, murine दिल में मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं की कम संख्या को देखते हुए Teflon निष्फल वैक्यूम तेल का उपयोग कर 35 मिमी बर्तन पर सम्मिलित करता है, इन कोशिकाओं की उपज में सुधार . कोशिकाओं तो चढ़ाना क्षेत्र को कम करने के लिए सम्मिलित भीतर रखा जाता है और उनके घनत्व बढ़ जाती किया जा सकता है. का प्रयोग Teflon भी सम्मिलित करता है उनके अलगाव के बाद और साथ ही साथ चढ़ाना अवधि के दौरान मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं की व्यवहार्यता में सुधार.
कुछ हृदय melanocyte कोशिकाओं की तरह हम इन कोशिकाओं की एक कम विभेदित राज्य का प्रतिनिधित्व करता है जो एक द्विध्रुवी आकारिकी निम्नलिखित अलगाव है. इसके अलावा, हम अलगाव के बाद 3 दिन के लिए हृदय melanocytes संवर्धन कोशिकाओं डेन्ड्राइट फार्म शुरू जहां मेलानोसाईट तरह phenotype के आगे भेदभाव प्रेरित करने के लिए लगता है कि पाया. हम भी इस प्रोटोकॉल संस्कृति में करने के लिए 10 दिनों के लिए रखा जा सकता है कि परिपक्व दिल से मेलानोसाईट कोशिकाओं की तरह पैदावार मिल गया है. हालांकि, proliferating बंद हो जाएगा और वृद्ध होनेवाला हो सकता है परिपक्व दिल से अलग संस्कृति मेलानोसाईट की तरह कोशिकाओं में 10 दिनों से परे. पृथक और चढ़ाया हृदय melanocytes बहिर्जात कारकों को उनके शारीरिक प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए इस तरह के शाही सेना की रूपरेखा या पढ़ाई के रूप में, सेलुलर electrophysiological विश्लेषण या अन्य आणविक / सेलुलर जैविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम VVPMDL को स्वास्थ्य पुरस्कार R01 HL105734 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया स्वास्थ्य अनुसंधान कैरियर पुरस्कार K08 HL094748 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा, भाग में, का समर्थन किया है. VVP अनुदान 11IRG900384 द्वारा समर्थित अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन का एक अभिनव शोधकर्ता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock conc.: 1x Working conc.: 1x |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock conc.: 100x Working conc.: 1x |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | Dissolve in DMSO Stock conc.: 3.2 μM Working conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.1 mg/ml Working conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dissolve in DPBS Stock conc.: 0.5 mM Working conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Dissolve in 10 mM acetic acid Stock conc.: 1 mg/ml Working conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Dissolve in water Stock conc.: 4 ng/μl Working conc.: 4 ng/ml |
References
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